RTL ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම
RTL ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් යනු 3'→5' exonuclease ක්‍රියාකාරකම් නොමැති සහ RNase H ක්‍රියාකාරකම් ඇති RNA සැකිල්ල මත යැපෙන DNA පොලිමරේස් වේ.මෙම එන්සයිමයට DNA අනුපූරක පොටක් සංස්ලේෂණය කිරීම සඳහා අච්චුවක් ලෙස RNA භාවිතා කළ හැකි අතර, එය පළමු කෙඳි cDNA සංස්ලේෂණයට යෙදිය හැක, විශේෂයෙන්ම RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) සඳහා.RTL ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් 1.0 සමඟ සසඳන විට, සංවේදීතාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු වී ඇති අතර, තාප ස්ථායීතාවය ශක්තිමත් වන අතර 65 ° C හි ප්රතික්රියාව වඩාත් ස්ථායී වේ.RTL reverse transcriptase (glycerol free) lyophilized සූදානම, lyophilized RT-LAMP ප්‍රතික්‍රියාකාරක ආදිය සකස් කිරීමට භාවිතා කළ හැක.
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
එක් ඒකකයක් පොලි(A)•oligo(dT)25 සැකිල්ල-ප්‍රයිමරයක් ලෙස භාවිතා කරමින් 50°C දී මිනිත්තු 20කින් dTTP 1 nmol අම්ල අවක්ෂේපිත ද්‍රව්‍ය බවට ඇතුළත් කරයි.
සංරචක
| සංරචකය | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transscriptase (Glycerol-free) (15U/μL) | 0.1 මිලි | 1 මිලි | 10 මිලි |
| 10×HC RTL බෆරය | 1.5 මිලි | 4×1.5 මිලි | 5×10 මිලි |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 මිලි | 2×1.5 මිලි | 3 × 10 මිලි |
ගබඩා තත්ත්වය
0°C ට අඩු ප්‍රවාහනය සහ -25°C~-15°C දී ගබඩා කළ යුතුය.
තත්ත්ව පාලනය
- හි අවශේෂ ක්‍රියාකාරකම්Endonuclease:1 μg λDNA සහ RTL2.0 ඒකක 15 ක් අඩංගු 50 μL ප්‍රතික්‍රියාවක් පැය 16 ක් 37 ℃ ට පුර්වීකරණය කරන ලද අතර ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් මගින් සෘණ පාලනයට සමාන රටාවක් පෙන්වයි.
- හි අවශේෂ ක්‍රියාකාරකම්Exonuclease:Hind Ⅲ දිරවන ලද λDNA 1 μg අඩංගු 50 μL ප්‍රතික්‍රියාවක් සහ RTL2.0 ඒකක 15 ක් පැය 16 ක් 37 ℃ ට පුර්වීකරණය කරන ලද අතර එය ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් සෘණ පාලනයට සමාන රටාවක් පෙන්වයි.
- හි අවශේෂ ක්‍රියාකාරකම්නිකේස්:50 μL ප්‍රතික්‍රියාවක් 1 μg supercoiled pBR322 සහ RTL2.0 ඒකක 15 ක් 37 ° C දී පැය 4 ක් පුර්වීකරණය කරන ලද අතර එය ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් සෘණ පාලනයට සමාන රටාවක් පෙන්වයි.
- හි අවශේෂ ක්‍රියාකාරකම්RNase:MS2 RNA හි 0.48 μg සහ RTL2.0 ඒකක 15 ක් අඩංගු 10 μL ප්‍රතික්‍රියාවක් පැය 4 ක් 37 ° C දී ඉන්කියුබේට් කරන ලද අතර එය ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් සෘණ පාලනයට සමාන රටාවක් පෙන්වයි.
- E. coli gDNA:සමඟ මනිනු ලැබේE.coliනිශ්චිත HCD හඳුනාගැනීමේ කට්ටල, RTL2.0 ඒකක 15ක 1ට වඩා අඩුවෙන් අඩංගු වේE. coliජෙනෝමය.
ප්‍රතික්‍රියා සැකසුම
cDNA සංශ්ලේෂණ ප්රොටෝකෝලය
| සංරචක | පරිමාව |
| සැකිල්ල RNA a | විකල්ප |
| ඔලිගෝ(dT) 18~25(50uM) හෝ සසම්භාවී ප්‍රයිමර් මිශ්‍රණය(60uM) | 2 μL |
| dNTP මිශ්‍රණය (මිලිමීටර් 10 බැගින්) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL බෆරය | 2 μL |
| න්යෂ්ටික රහිත ජලය | 20 μL දක්වා |
සටහන්:
1) සම්පූර්ණ RNA හි නිර්දේශිත මාත්‍රාව 1ng~1μg වේ
2) mRNA හි නිර්දේශිත මාත්‍රාව 50ng~100ng විය
තාප-පුරුද්දක් සඳහා බයිසිකල් පැදීමේ කොන්දේසි ප්රතික්රියාව:
| උෂ්ණත්වය (°C) | කාලය |
| 25 °Ca | විනාඩි 5 |
| 55 °C | විනාඩි 10b |
| 80 °C | විනාඩි 10 |
සටහන්:
1) සසම්භාවී ප්‍රයිමර් මිශ්‍රණය භාවිතා කරන්නේ නම්, 25 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු පියවරක්.
2) ඉලක්ක ප්‍රාථමික මිශ්‍රණය භාවිතා කරන්නේ නම්, විනාඩි 10-30ක් සඳහා 55 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු පියවරක්.
RT-LAMP ප්රොටෝකෝලය
| සංරචක | පරිමාව | අවසාන සාන්ද්රණය |
| සැකිල්ල RNA | විකල්ප | ≥10 පිටපත් |
| dNTP මිශ්‍රණය (10mM) | 3.5 μL | 1.4 මි.මී |
| FIP/BIP ප්‍රයිමර් (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 ප්‍රයිමර් (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB ප්‍රයිමර් (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/ප්රතික්රියාව |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/ප්රතික්රියාව |
| Bst V2 DNA පොලිමරේස් (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ප්රතික්රියාව |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (මුළු 8 mM) |
| 10×HC RTL බෆරය (හෝ 10×HC Bst V2 බෆරය) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| න්යෂ්ටික රහිත ජලය | 25 μL දක්වා | - |
සටහන්:
1) එකතු කිරීම සඳහා කෙටියෙන් සුලිය සහ කේන්ද්‍රාපසාරී මගින් මිශ්ර කරන්න.පැය 1 ක් සඳහා 65 ° C දී නිරන්තර උෂ්ණත්වයේ ඉන්කියුබේෂන්.
2) බෆර දෙක අන්තර් ක්රියාකාරී වන අතර එකම සංයුතිය ඇත.
සටහන්
1.මෙම නිෂ්පාදනය -20 °C දී ගබඩා කළ විට සුදු ඝනයක් සාදනු ඇත.එය -20 ° C සිට පිටතට ගෙන විනාඩි 10 ක් පමණ අයිස් මත තබන්න.උණු කිරීමෙන් පසු, එය සෙලවීමෙන් හා මිශ්ර කිරීමෙන් භාවිතා කළ හැක.
2.සීඩීඑන්ඒ නිෂ්පාදනය -20°C හෝ -80°C දී ගබඩා කළ හැක හෝ PCR ප්රතික්රියාව සඳහා වහාම භාවිතා කළ හැක.
3.RNase දූෂණය වැලැක්වීම සඳහා, කරුණාකර පර්යේෂණාත්මක ප්‍රදේශය පිරිසිදුව තබා ගන්න, ක්‍රියා කිරීමේදී පිරිසිදු අත්වැසුම් සහ වෙස්මුහුණු පළඳින්න.
