Rnase Inhibitor
Murine RNase inhibitor යනු E.coli වලින් ප්‍රකාශ කර පිරිසිදු කරන ලද ප්‍රතිසංයෝජක murine RNase inhibitor වේ.එය සහසංයුජ නොවන බන්ධන හරහා 1:1 අනුපාතයකින් RNase A, B හෝ C වෙත බන්ධනය වන අතර එමඟින් එන්සයිම තුනේ ක්රියාකාරිත්වය වළක්වන අතර RNA ක්ෂය වීමෙන් ආරක්ෂා කරයි.කෙසේ වෙතත්, එය Aspergillus වෙතින් RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H හෝ RNase වලට එරෙහිව ඵලදායී නොවේ.Murine RNase inhibitor RT-PCR, RT-qPCR සහ IVT mRNA මගින් පරීක්ෂා කරන ලද අතර, විවිධ වාණිජ ප්‍රතිලෝම පිටපත්, DNA පොලිමරේස් සහ RNA පොලිමරේස් සමඟ අනුකූල විය.
මානව RNase inhibitors හා සසඳන විට, murine RNase inhibitor හි නිෂේධකය අක්‍රිය කිරීමට හේතු වන ඔක්සිකරණයට ඉතා සංවේදී cysteine දෙකක් අඩංගු නොවේ.එය DTT හි අඩු සාන්ද්‍රණයක (1 mM ට අඩු) ස්ථායී කරයි.මෙම විශේෂාංගය එය DTT හි ඉහළ සාන්ද්‍රණය ප්‍රතික්‍රියාවට අහිතකර වන ප්‍රතික්‍රියා වලදී භාවිතා කිරීමට සුදුසු වේ (උදා: තත්‍ය කාලීන RT-PCR).
Aඅයදුම්පත්රය
RNA හායනය වැලැක්වීම සඳහා RNase මැදිහත්වීම් හැකි ඕනෑම පරීක්ෂණයකදී මෙම නිෂ්පාදනය බහුලව භාවිතා කළ හැක, එනම්:
1.cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, ආදියෙහි පළමු නූල් සංශ්ලේෂණය.
2.in vitro transscription/translation (උදා, in vitro virus replication system) තුළදී RNA ක්ෂය වීමෙන් ආරක්ෂා කරයි.
3.RNA වෙන් කිරීම සහ පිරිසිදු කිරීමේදී RNase ක්‍රියාකාරකම් වලක්වාලීම.
ගබඩා කොන්දේසි
නිෂ්පාදිතය -25～-15 ℃, වසර 2 ක් සඳහා වලංගු වේ.
ගබඩා බෆරය
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT සහ 50% glycerol.
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
5ng ribonuclease A හි ක්රියාකාරිත්වය 50% කින් නිෂේධනය කිරීමට අවශ්‍ය murine RNase inhibitor ප්‍රමාණය එක් ඒකකයක් (U) ලෙස අර්ථ දක්වා ඇත.
ප්රෝටීන් අණුක බර
murine RNase inhibitor හි අණුක බර 50 kDa වේ.
තත්ත්ව පාලනය
Exonuclease ක්‍රියාකාරකම්:
40 U murine RNase inhibitor 1 μg λ -Hind III digest DNA 37℃ දී පැය 16 ක් සඳහා agarose gel electrophoresis මගින් තීරණය කරන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් ලබා නොදේ.
Endonuclease ක්රියාකාරිත්වය:
40 U murine RNase inhibitor 1μg λ DNA සමඟ 37℃ පැය 16ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් නිර්ණය කරන පරිදි පිරිහීමක් සිදු නොවේ.
නිකිං ක්‍රියාකාරකම්:
40U murine RNase inhibitor 1μg pBR322 සමඟ 37℃ පැය 16ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් තීරණය වන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් නොලැබේ.
RNase ක්රියාකාරිත්වය:
40U murine RNase inhibitor 1.6μg MS2 RNA සමඟ 37℃ හි 4h සඳහා agarose gel electrophoresis මගින් තීරණය කරන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් නොලැබේ.
E.coli DNA:
40 U murine RNase inhibitor, E. coli 16S rRNA ලොකස් සඳහා විශේෂිත වූ ප්‍රයිමර් සමඟ TaqMan qPCR භාවිතයෙන් E. coli ජානමය DNA පැවතීම සඳහා පරීක්ෂා කරනු ලැබේ.E. coli ජානමය DNA දූෂණය ≤ 0.1 pg/40 U වේ.
Notes
1.ප්‍රචණ්ඩ දෝලනය හෝ ඇවිස්සීම එන්සයිම අක්‍රිය වීමට හේතු වේ.
2.මෙම නිෂේධකයේ ප්‍රශස්ථ උෂ්ණත්ව පරාසය 25-55 ℃ වන අතර එය 65℃ සහ ඊට ඉහලින් අක්‍රිය විය.
3. RNase H, RNase 1 සහ RNase T1 වල ක්‍රියාකාරකම් murine RNase inhibitor මගින් නිෂේධනය කර නැත.
4. RNase ක්‍රියාකාරකම් වල නිෂේධනය pH අගය පුළුල් පරාසයක දක්නට ලැබුණි (pH 5-9 සියල්ල ක්‍රියාකාරී විය), සහ ඉහළම ක්‍රියාකාරකම් pH 7-8 හි නිරීක්ෂණය විය.
5. ribonucleases සාමාන්‍යයෙන් denaturing තත්ත්‍වයන් යටතේ ක්‍රියාකාරීත්වය රඳවා තබා ගන්නා බැවින්, ribonuclease සමඟ සංකීර්ණ වී ඇති RNase Inhibitor අණු නිෂේධනය නොකිරීමට වගබලා ගත යුතුය.සක්‍රීය රයිබොනියුක්ලීස් මුදා හැරීම වැලැක්වීම සඳහා, 50 °C ට වැඩි උෂ්ණත්වයන් සහ යූරියා හෝ වෙනත් නාශක කාරක සාන්ද්‍රණය අධික වීම වැළැක්විය යුතුය.
