EndoFree ප්ලාස්මිඩ් මැක්සි කට්ටලය
මෙම කට්ටලය බැක්ටීරියා ලයිස් කිරීම සඳහා වැඩිදියුණු කරන ලද SDS-ක්ෂාරීය ලයිසිස් ක්‍රමයක් භාවිතා කරමින් එක රැයකින් වගා කරන ලද බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයේ මිලි ලීටර් 150 - 300 සිට නිස්සාරණය කිරීම සඳහා සුදුසු වේ.බොරතෙල් නිස්සාරණය අද්විතීය එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර් සමඟ වරණාත්මකව ඒකාබද්ධ කර එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීම සඳහා කේන්ද්රාපසාරී කිරීම මගින් වෙන් කරනු ලැබේ.ඉන්පසුව, සිලිකා ජෙල් පටලය අධික ලුණු සහ අඩු pH තත්ව යටතේ ද්‍රාවණයේ ඇති ප්ලාස්මිඩ් DNA සමඟ තෝරා බේරා බන්ධනය කරයි.මෙයට පසුව අපිරිසිදු හා අනෙකුත් බැක්ටීරියා සංරචක ඉවත් කිරීම සඳහා වොෂ් බෆරය එකතු කරනු ලැබේ.අවසාන වශයෙන්, සිලිකන් න්‍යාස පටලයෙන් පිරිසිදු ප්ලාස්මිඩ් DNA ඉවත් කිරීම සඳහා අඩු ලුණු, ඉහළ pH elution බෆරයක් භාවිතා කරයි.සිලිකා ජෙල් පටලය විශේෂ අවශෝෂණ පටලයක් භාවිතා කරන අතර තීරුව සහ තීරුව අතර අවශෝෂණ ප්‍රමාණයේ වෙනස ඉතා කුඩා වන අතර පුනරාවර්තන හැකියාව යහපත් වේ.ෆීනෝල්, ක්ලෝරෝෆෝම් සහ අනෙකුත් විෂ ප්‍රතික්‍රියාකාරක අවශ්‍ය නොවන අතර එතනෝල් වර්ෂාපතන පියවරද අවශ්‍ය නොවේ.මෙම කට්ටලය 80% -90% නිස්සාරණ අනුපාතයක් සහිතව, පිරිසිදු අධි-පිටපත් ප්ලාස්මිඩ් DNA 0.2 -1.5 mg වේගයෙන් නිස්සාරණය කිරීමට භාවිතා කළ හැක.කට්ටලය එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කරන අද්විතීය ක්‍රියාවලි සූත්‍රයක් භාවිතා කරයි, එන්ඩොටොක්සින් වල අන්තර්ගතය අතිශයින් අඩු වන අතර සෛල මාරු කිරීමේ බලපෑම විශිෂ්ටයි.නිස්සාරණය කරන ලද ප්ලාස්මිඩය එන්සයිම ජීර්ණය, PCR, in vitro පිටපත් කිරීම, පරිවර්තනය කිරීම, අනුක්‍රමණය කිරීම සහ අනෙකුත් අණුක ජීව විද්‍යා පරීක්ෂණ සඳහා සෘජුවම භාවිතා කළ හැක.
ගබඩා කොන්දේසි
RNaseA -30 ~ -15℃ ගබඩා කර ≤0℃ ප්රවාහනය කළ යුතුය.
එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර් මාසයක් සඳහා 2 ~ 8℃ දී ගබඩා කළ හැක, දිගුකාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා -30 ~ -15℃ ගබඩා කළ හැක.සහ ≤0℃ ප්රවාහනය කෙරේ.
අනෙකුත් සංරචක කාමර උෂ්ණත්වයේ (15 ~25℃) ගබඩා කර කාමර උෂ්ණත්වයේ ප්රවාහනය කළ යුතුය.
සංරචක
| සංරචක | 10RXNS |
| ආර්නාස් ඒ | 750 μL |
| බෆරය P1 | 75 මිලි |
| බෆරය P2 | 75 මිලි |
| බෆරය P4 | 75 මිලි |
| එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර් | 25 මිලි |
| බෆර් PW | 2 × 22 මිලි |
| බෆර් TB | 20 මිලි |
| FastPure DNA මැක්සි තීරු (එක් එක් මිලි ලීටර් 50 එකතු කිරීමේ නලයක) | 10 |
| එන්ඩොටොක්සින්-නිදහස් එකතු කිරීමේ නළය | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA ඉවත් කිරීමට භාවිතා කරයි.
බෆරය P1:බැක්ටීරියා අත්හිටුවීමේ බෆරය, පළමු භාවිතයට පෙර RNaseA Buffer P1 වෙත එක් කරන්න.
බෆරය P2:බැක්ටීරියා ලයිසිස් බෆරය (SDS/NaOH අඩංගු).
බෆරය P4:උදාසීන බෆරය.
එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර්:බොර ප්ලාස්මිඩ් නිස්සාරණයෙන් එන්ඩොටොක්සින් ඵලදායී ලෙස ඉවත් කරන්න.
බෆර් PW:බෆරය සෝදන්න, පළමු භාවිතයට පෙර එතනෝල් නියමිත පරිමාව එකතු කරන්න.
බෆර් TB:ඉවත් කිරීමේ බෆරය.
FastPure DNA මැක්සි තීරු:ප්ලාස්මිඩ් DNA adsorption තීරු.
එකතු කිරීමේ නල 50 ml:එකතු කිරීමේ නල පෙරීම.
එන්ඩොටොක්සින්-නිදහස් එකතු කිරීමේ නළය:ප්ලාස්මිඩ් DNA එකතු කිරීමේ නල.
සකස් කළ ද්රව්ය
නිරපේක්ෂ එතනෝල්, isopropanol, 50 ml රවුම්-පහළ කේන්ද්රාපසාරී නල සහ 50 ml endotoxin-නිදහස්කේන්ද්රාපසාරී නල.
අයදුම්පත්
මෙම නිෂ්පාදනය බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයේ මිලි ලීටර් 150 - 300 සිට ප්ලාස්මිඩ් විශාල වශයෙන් නිස්සාරණය කිරීම සඳහා සුදුසු වේ.එක රැයකින් සංස්කෘතික.
අත්හදා බැලීමේ ක්රියාවලිය
1. එක රැයකින් වගා කරන ලද බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 150 - 200 (මිලි ලීටර් 300 ට නොවැඩි) ගෙන කේන්ද්රාපසාරී1 - 2 විනාඩි සඳහා 11,000 rpm (12,000 × g) පමණ.සුපිරිසිදු ද්රව්ය ඉවත් කර බැක්ටීරියා එකතු කරන්න.
Δ බැක්ටීරියා ද්‍රාවණය මිලිලීටර් 50කට වඩා එකතු කිරීමේදී බැක්ටීරියා ද්‍රාවණය, කේන්ද්රාපසාරී කිරීම, අධි ප්‍රවාහය ඉවත දැමීම සහ අනෙකුත් පියවරයන් සඳහා එම මිලිලීටර් 50 නලයට එකතු කිරීමෙන් බැක්ටීරියාව එකතු කර ගත හැක.
කීප වරක්.
2. Buffer P1 මිලිලීටර් 7.5 ක් (කරුණාකර RNaseA බෆර් P1 වෙත එකතු කර ඇත්දැයි පරීක්ෂා කරන්න) කේන්ද්රාපසාරී වෙත එක් කරන්න.බැක්ටීරියා අඩංගු නලයක් සහ සුලිය හෝ නල මාර්ගයෙන් තරයේ මිශ්ර කරන්න.
Δ මෙම පියවරේදී බැක්ටීරියා සම්පූර්ණයෙන් නැවත ආරම්භ කිරීම අස්වැන්න ලබා ගැනීම සඳහා ඉතා වැදගත් වන අතර, නැවත ලබා දීමෙන් පසු බැක්ටීරියා පොකුරු නොතිබිය යුතුය.තරයේ මිශ්ර නොකළ බැක්ටීරියා පොකුරු තිබේ නම්, එය ලයිසිස් වලට බලපාන අතර, අඩු අස්වැන්නක් සහ සංශුද්ධතාවයක් ඇති කරයි.බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයේ OD600 0.65 නම්, බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයේ මිලි ලීටර් 150 කින් නිස්සාරණය කිරීමේදී බෆර් P1 මිලි ලීටර් 7.5 ක් භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ;OD600 0.75 වන විට, Buffer P1 මිලි ලීටර් 8 ක් භාවිතා කළ යුතු අතර, Buffers P2 සහ P4 පරිමාවන් ඒ අනුව වෙනස් කළ යුතුය.බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයේ පරිමාව මිලි ලීටර් 200 දක්වා වැඩි කළහොත් එය නිර්දේශ කෙරේBuffers P1, P2 සහ P4 පරිමාව සමානුපාතිකව වැඩි කළ යුතුය.
3. පියවර 2 සිට බැක්ටීරියා අත්හිටුවීමට Buffer P2 මිලි ලීටර් 7.5 ක් එකතු කර 6 - 8 දක්වා මෘදු ලෙස ඉහළට සහ පහළට මිශ්ර කරන්න.වේලාවන් සහ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 4 - 5 ක් සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කරන්න.
Δ තරයේ මිශ්ර කිරීම සඳහා මෘදු ලෙස පෙරළන්න.සුලිය ප්‍රවේණික DNA ඛණ්ඩනයට හේතු වනු ඇත, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස නිස්සාරණය කරන ලද ප්ලාස්මිඩයේ ප්‍රවේණික DNA කොටස් ඇතිවේ.මෙම අවස්ථාවේදී, ද්‍රාවණය දුස්ස්රාවී සහ පාරභාසක බවට පත් වන අතර එමඟින් බැක්ටීරියා සම්පූර්ණයෙන්ම ලයිස් කර ඇති බව පෙන්වයි.ප්ලාස්මිඩ විනාශ වීම වළක්වා ගැනීම සඳහා කාලය විනාඩි 5 නොඉක්මවිය යුතුය.විසඳුම පැහැදිලි නැතිනම්, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස බොහෝ බැක්ටීරියා තිබිය හැකඅසම්පූර්ණ ලයිසිස්, එබැවින් බැක්ටීරියා ප්රමාණය නිසි ලෙස අඩු කළ යුතුය.
4. Buffer P2 මිලිලීටර් 7.5 ක් බැක්ටීරියා අත්හිටුවීම සඳහා 3 වන පියවරේ සිට එකතු කර වහාම 6 - 8 වාරයක් මෘදු ලෙස පෙරළන්න, විසඳුම Buffer P2 සම්පූර්ණයෙන්ම උදාසීන කිරීමට ඉඩ දෙන්න.මෙම අවස්ථාවේදී, සුදු flocculent වර්ෂාපතනය දිස්විය යුතුය.මිනිත්තු 10 - 15 ක් සඳහා 11,000 rpm (12,000 × g) ට වඩා වැඩි කේන්ද්රාපසාරී, නව මිලිලීටර් 50 රවුම්-පහළ කේන්ද්රාපසාරී නලයකට (ස්වයං-සූදානම්) සුපර්නැටන්ට් ප්‍රවේශමෙන් පිපෙට් කරන්න.පාවෙන සුදු අවක්ෂේපය අපේක්ෂා කරන්න.
Δ Buffer P4 එකතු කර හොඳින් මිශ්ර කිරීමට වහාම පෙරළන්න.උදාසීන කිරීමට බලපාන දේශීය වර්ෂාපතනය නිෂ්පාදනය වැළැක්වීම සඳහා ද්‍රාවණය පුරා සුදු වර්ෂාපතනය ඒකාකාරව බෙදා හරින තෙක් නළය රැඳී සිටින්න.කේන්ද්‍රාපසාරණයට පෙර ඒකාකාර සුදු ප්‍රවාහ අවක්ෂේපයක් නොමැති නම් සහ කේන්ද්රාපසාරී කිරීමෙන් පසු අධි ප්‍රවාහය පැහැදිලි නැතිනම්, නළය විය හැක.තවත් විනාඩි 5 ක් සඳහා කේන්ද්රාපසාරී.
5. එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර් පරිමාව මෙන් 0. 1 ගුණයක් (උපරිනාටක පරිමාවෙන් 10%, මිලි ලීටර් 2.2 ක් පමණ) 4 වන පියවරේ සිට සුපිරි ප්‍රවාහයට එකතු කර මිශ්ර කිරීමට ප්‍රතිලෝම කරන්න.ද්‍රාවණය අයිස් ස්නානයක තබා හෝ තලා දැමූ අයිස් (හෝ ශීතකරණ අධිශීතකරණය) තුළට ද්‍රාවණය කැළඹිලි ස්වභාවයේ සිට පැහැදිලි සහ විනිවිද පෙනෙන (හෝ නිශ්චලව) දක්වා වෙනස් වන තෙක් මිනිත්තු 5ක් තබන්න.තරමක් කැළඹිලි), සහ ඉඳහිට කිහිප වතාවක් මිශ්ර.
Δ එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර් අධි ප්‍රනාටකයට එකතු කළ පසු, අධි ප්‍රවාහය කැළඹිලි බවට පත් වනු ඇත, නමුත්අයිස් තටාකයේ සිසිලනයෙන් පසු සුපිරිසිදු වීම (හෝ තරමක් කැළඹිලි සහිත) විය යුතුය.
6. සුපර්නැටන්ට් කාමර උෂ්ණත්වයේ (>25℃) විනාඩි 10 - 15 ක් තැබූ පසු, එය කැළඹිලි සහිත වේඑහි උෂ්ණත්වය කාමර උෂ්ණත්වයට වැඩිවේ.එවිට සුපර්නැටන්ට් මිශ්ර කිරීම සඳහා පෙරළා දැමිය යුතුය.
Δ කාමර උෂ්ණත්වය අඩු නම් හෝ ඔබට නිස්සාරණය කිරීමේ කාලය අඩු කිරීමට අවශ්‍ය නම්, අධි ප්‍රවාහය 37 ~ 42 ℃ ජල ස්නානයක විනාඩි 5 - 10 ක් පුර්ව ප්‍රවාහයෙන් පසුව සිදු කළ හැක.කැළඹිලි සහිත වෙයි.
7. අදියර වෙන් කිරීම සඳහා කාමර උෂ්ණත්වයේ (උෂ්ණත්වය >25℃ විය යුතුය) විනාඩි 10ක් සඳහා 11,000 rpm (12,000 × g) දී අධි ප්‍රවාහක කේන්ද්රාපසාරී කරන්න.ඉහළ ජලීය අවධියේ DNA අඩංගු වන අතර පහළ නිල් තෙල් සහිත අදියර ස්ථරයේ එන්ඩොටොක්සින් සහ අනෙකුත් අපද්‍රව්‍ය අඩංගු වේ.මාරු කරන්නDNA අඩංගු ජලීය අදියර නව නලයකට සහතෙල් සහිත තට්ටුව ඉවතලන්න.
Δ ඵලදායි අවධි වෙන්වීමක් සිදු නොවන බැවින් කේන්ද්‍රාපසාරීයේදී උෂ්ණත්වය 25℃ ට වැඩි විය යුතුයඋෂ්ණත්වය ඉතා අඩු නම් සිදු වේ.
Δ අදියර වෙන් කිරීම ඵලදායී නොවේ නම්, කේන්ද්රාපසාරී උෂ්ණත්වය 30℃ සහකේන්ද්රාපසාරී කාලය විනාඩි 15 දක්වා වැඩි කළ හැක.
Δ එන්ඩොටොක්සින් සහ අනෙකුත් අපද්‍රව්‍ය අඩංගු බැවින් නිල් පැහැති තෙල් සහිත තට්ටුව උරා නොගන්න.
යාන්ත්රණය
Resuspension Lysis උදාසීන කිරීම
◇ 7.5 ml Buffer P1 එකතු කරන්න
◇ 7.5 ml Buffer P2 එකතු කරන්න
◇ 7.5 ml Buffer P4 එකතු කරන්න
එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීම
◇එන්ඩොටොක්සින් ස්කැවෙන්ජර් වල සුපිරි ප්රමාණය මෙන් 0. 1 ගුණයක් එකතු කරන්න
බැඳීම සහ සේදීම
◇ isopropanol පරිමාව මෙන් 0.5 ගුණයක් එකතු කරන්න
◇ 10 ml Buffer PW එකතු කරන්න
◇ 10 ml Buffer PW එකතු කරන්න
ඉවත් කිරීම
◇ 1 - 2 ml බෆර් TB හෝ Endotoxin-free ddH2O එකතු කරන්න
