සෘජු PCR කට්ටලයක් සිටුවන්න
බළලා අංකය: HCR2020A
පැලෑටි සෘජු PCR කට්ටලය ශාක පත්ර, බීජ ආදිය සෘජුව විස්තාරණය කිරීම සඳහා සුදුසු වන අතර, පොලිසැකරයිඩ සහ පොලිෆෙනෝල් අඩංගු නොවන ශාක සාම්පලවල ඉහළ ප්‍රතිඵලයක් පිරික්සීම සඳහා භාවිතා කළ හැක.යොමු කරන ලද පරිණාමය මත පදනම් වූ සෘජු විස්තාරණ DNA පොලිමරේස් ශාකවල PCR inhibitors වලට වඩා ඉහළ ඉවසීමක් ඇත.මේ අතර, එය 5 kb තුළ DNA කොටස් විස්තාරණය කිරීම සඳහා සුදුසු වන ඉහළ විස්තාරණ කාර්ය සාධනය පවත්වාගෙන යයි.කට්ටලයේ ඇති අද්විතීය ලයිසිස් බෆරය A නැවුම් හෝ ශීත කළ ශාක පටක ලයිස් කිරීමට භාවිතා කළ හැකිය.එය ක්‍රියාත්මක කිරීමට පහසු වන අතර ලයිසේට් පිරිසිදු කිරීමකින් තොරව විස්තාරණය සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කළ හැකිය.නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම සිදු කිරීමෙන් පසු බොරතෙල් සාම්පල ඵලදායි ලෙස විස්තාරණය කිරීමට හැකි වන පරිදි ආරක්ෂිත කාරක පද්ධතිය තුළ අඩංගු වේ.2 × Plant Direct Master Mix හට වර්ධක ප්‍රතික්‍රියාව සිදු කිරීමට ප්‍රාථමික සහ සැකිලි එකතු කිරීමට පමණක් අවශ්‍ය වේ, එමගින් නල කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් අඩු කිරීම සහ ප්රතිඵල හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදානය සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය වැඩි දියුණු කිරීම.
සංරචක
| සංරචක | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × පැල සෘජු මාස්ටර් මිශ්‍රණය | 1.25 මිලි | 4 × 1.25 මිලි |
| පැල සෘජු ලිසිස් බෆරය A | 5 මිලි | 20 මිලි |
| පැල සෘජු ලිසිස් බෆරය B* | 5 මිලි | 20 මිලි |
*Plant Direct Lysis Buffer B යනු විකල්ප ප්‍රතික්‍රියාකාරකයකි, එය සාම්පල ගබඩා කිරීමේ කාලය දීර්ඝ කිරීම සඳහා ශාක සෘජු ලයිසිස් බෆරය A උදාසීන කිරීමට භාවිතා කරයි.එය සැබෑ තත්ත්වය අනුව භාවිතා කළ හැකිය.
ගබඩා කොන්දේසි
2 × පැල සෘජු මාස්ටර් මිශ්‍රණය, -30 ~ -15℃ ගබඩා කර නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම වළක්වා ගන්න;පැල සෘජු ලිසිස් බෆරය, ගබඩා කරන්න -30 ~ -15℃ හෝ 2 ~ 8℃.
අත්හදා බැලීමේ ක්රියාවලිය
නියැදි සැකසීම–ශාක පත්ර
සෘජු ක්රමය:තරුණ කොළ භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.කුඩා හා ඒකාකාර සාම්පලයක් ලබා ගැනීම සඳහා 0.5 - 3 mm ස්ථාවර විෂ්කම්භයක් සහිත සිදුරු පන්ච් භාවිතා කරන්න, ඉන්පසු PCR පද්ධතියට නියැදිය කෙලින්ම එකතු කරන්න (50 μl පද්ධතිය නිර්දේශ කෙරේ).සටහන, නියැදිය PCR ද්‍රාවණයේ ඇති අතර නල බිත්තියට එරෙහිව නොවන බවට වග බලා ගන්න.දිගු කොටස් සහ සංකීර්ණ සාම්පල විස්තාරණය කිරීම සඳහා සෘජු PCR භාවිතා කරන්නේ නම්, කුඩා විෂ්කම්භය (0.5 - 1 මි.මී.) සහිත නියැදියක් සැකිල්ලක් ලෙස භාවිතා කිරීම වඩා හොඳ ප්රතිඵල ලබා ගැනීමට උපකාරී වේ.
ඇඹරුම් ලිස්සි ක්රමය:තරුණ කොළ භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.කුඩා කොළ කැබැල්ලක් (විෂ්කම්භය 1 - 3 mm පමණ) ගෙන එය 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab දමා, හැකිතාක් අඹරා ගන්න (මෙම පියවර 100 μl පයිප්ප තුඩකින් පත්‍රය මිරිකීමෙන් කළ හැකිය. නියැදිය පොඩි කිරීමට) .පත්ර පටක විශාල ප්‍රමාණයක් භාවිතා කරන්නේ නම් (මි.මී. 7 නොඉක්මවිය යුතුය), තනුක බෆරයේ පරිමාව 50 μl දක්වා වැඩි කරන්න.කොළ ඇඹරීමෙන් පසුව, විසඳුම කොළ පාටින් දිස්විය යුතුය.කෙටි කේන්ද්‍රාපසාරණයකින් පසුව, ප්රතික්රියා සැකිල්ලක් ලෙස PCR පද්ධතියට 1 μl supernatant එක් කරන්න.
තාප ලයිසිස් ක්රමය:තරුණ කොළ භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.කුඩා කොළ කැබැල්ලක් (විෂ්කම්භය 1 - 3 mm පමණ) ගෙන එය 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A හි තබා විනාඩි 5 - 10 ක් 95 ° C දී රත් කරන්න.ලයිස් කිරීමට අපහසු කොළ (විනාඩි 20 කට නොවැඩි) සඳහා ලයිසිස් කාලය සුදුසු පරිදි දීර්ඝ කළ හැක.පත්ර පටක විශාල ප්‍රමාණයක් භාවිතා කරන්නේ නම් (මි.මී. 7 නොඉක්මවිය යුතුය), තනුක බෆරයේ පරිමාව 50 μl දක්වා වැඩි කරන්න.රත් වූ පසු, කෙටියෙන් කේන්ද්‍රාපසාරී කර, ප්රතික්රියා අච්චුවක් ලෙස PCR පද්ධතියට 1 μl supernatant එක් කරන්න.
නියැදි සැකසීම- ශාක බීජ
ඇඹරුම් ලිස්සි ක්රමය:මිලිමීටර් 5 ක විෂ්කම්භයක් සහිත බීජ කැපීම සඳහා හිස්කබලක් භාවිතා කරන්න, ඒවා 100 μl ප්ලාන්ට් ඩිරෙක්ට් ලයිසිස් බෆර් A ට එකතු කරන්න, සහ නියැදිය පයිප්ප තුඩකින් හෝ වෙනත් මෙවලම් සමඟ අඹරන්න.සුලිය කෙටියෙන් හා කාමර උෂ්ණත්වයේ විනාඩි 3 - 5 ක් රැඳී සිටීමට ඉඩ දෙන්න.බීජ නියැදිය තනුක බෆරයේ ගිලී ඇති බවට වග බලා ගන්න.කෙටි කේන්ද්‍රාපසාරණයකින් පසුව, ප්රතික්රියා අච්චුවක් ලෙස PCR පද්ධතියට අධි ප්‍රවාහක 1 μl එක් කරන්න.
තාප ලයිසිස් ක්රමය:මිලිමීටර් 5 ක විෂ්කම්භයක් සහිත බීජ කැපීම සඳහා හිස්කබලක් භාවිතා කරන්න, 100 μl ප්ලාන්ට් ඩිරෙක්ට් ලයිසිස් බෆර් A ට එකතු කරන්න, සහ 95 ° C දී විනාඩි 5 - 10 ක් රත් කරන්න.ලයිස් කිරීමට අපහසු කොළ (විනාඩි 30 ට නොඅඩු) සඳහා ලයිසිස් කාලය සුදුසු පරිදි දීර්ඝ කළ හැක.රත් වූ පසු, කෙටියෙන් කේන්ද්‍රාපසාරී කර, ප්රතික්රියා අච්චුවක් ලෙස PCR පද්ධතියට 1 μl අධි ප්‍රවාහයක් එක් කරන්න.
ඒ.සුදුසු ප්රමාණයේ සාම්පල කැපීම සඳහා කතුර හෝ වෙනත් මෙවලම් ද භාවිතා කළ හැකිය;පන්ච් හෝ කතුර නැවත භාවිතා කරන්නේ නම්, සාම්පල අතර හරස් දූෂණය වැළැක්වීම සඳහා එක් එක් භාවිතයට පෙර ඒවා 2% සෝඩියම් හයිපොක්ලෝරයිට් ද්‍රාවණයකින් පිරිසිදු කළ යුතුය.
බී.ප්ලාන්ට් ඩිරෙක්ට් ලයිසිස් බෆරය භාවිතයට පෙර සම්පූර්ණයෙන්ම දිය වී ඇති බවට වග බලා ගන්න.බෆරය දුස්ස්රාවී හෝ අවක්ෂේප සහිත නම්, එය භාවිතයට පෙර සම්පූර්ණයෙන්ම උණු කිරීම සඳහා 37℃ රත් කළ හැක.
c.ප්රතික්රියා පද්ධතියේ සැකිලි පරිමාව ශාක ද්‍රව්‍ය පරිමාවේ සහ එකතු කරන ලද තනුක පරිමාවේ වෙනස අනුව සුදුසු පරිදි සකස් කළ හැක.
පැල සෘජු ලිසිස් බෆරය
මෙම නිෂ්පාදනයේ අඩංගු Plant Direct Lysis Buffer A බොහෝ ශාක පටක වල ජෙනෝමය මුදා හැරීමට දැඩි ලෙස ප්‍රශස්ත කර ඇති අතර 4℃ හි බොර ශාක කෙටි කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා සුදුසු වේ.නියැදිය දිගු කාලයක් (උදා, මාස 1 - 2) ගබඩා කිරීමට අවශ්‍ය නම්, අධි ප්‍රවාහය නව EP නලයකට මාරු කර එය -20℃ හි ගබඩා කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.සාම්පල වඩාත් ස්ථායීව ගබඩා කිරීම සඳහා, මාරු කරන ලද අධි ප්‍රවාහයට සමාන ප්ලාන්ට් ඩිරෙක්ට් ලයිසිස් බෆර් බී එකතු කරන්න, හොඳින් මිශ්‍ර කර -20℃ හි ගබඩා කරන්න.ශාක සාම්පල සහ ප්රාන්ත අනුව ස්ථාවර ගබඩා කාලය වෙනස් වේ.
ප්රතික්රියා පද්ධතිය
| ddH2O | 20.0 µl දක්වා | 50.0 µl දක්වා |
| 2 × පැල සෘජු මාස්ටර් මිශ්‍රණයa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| ප්‍රාථමික 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ප්‍රයිමර් 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ශාක පත්ර/බොර සාරය සාම්පල(නියැදි සැකසීම වෙත යොමු වන්න) | 0.5 – 3 mm පත්ර තැටිය/x µl | 0.5 – 3 mm පත්ර තැටිය/x µl |
ඒ.එහි Mg අඩංගු වේ2+2 mM අවසාන සාන්ද්රණයකදී.
බී.එක් එක් ප්‍රාථමිකය සඳහා අවසාන සාන්ද්‍රණය 0.4μM භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.ප්‍රයිමර් අධික ලෙස භාවිතා කිරීම නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය වැඩි කිරීමට හේතු වේ.
c.භාවිතා කරන නියැදි ප්රමාණය සැබෑ තත්ත්වය අනුව සකස් කළ හැක.බොරතෙල් ලයිස්ඩ් නියැදියක එක් ප්‍රතික්‍රියාවක භාවිතා කරන ප්රමාණය ප්‍රතික්‍රියාවේ මුළු පරිමාවෙන් 2% - 20% අතර ප්‍රමාණයක් සකස් කළ හැක.ඕනෑවට වඩා සාම්පල භාවිතා කිරීම විස්තාරණය අසාර්ථක වීමට හේතු විය හැක.
ප්රතික්රියා වැඩසටහන
| පියවර | උෂ්ණත්වය | කාලය |
| ආරම්භක අවප්රමාණය | 98℃ | විනාඩි 5 |
| Denaturation | 95℃ | තත්පර 10 |
| නිර්වින්දනය | 58 ~ 72℃ | තත්පර 15 |
| දිගු කිරීම | 72℃ | තත්පර 30 |
| අවසාන දිගුව | 72℃ | විනාඩි 5 |
ඒ.ආරම්භක අවප්රමාණය (98℃, මිනිත්තු 5) PCR විස්තාරණය සඳහා භාවිතා කළ හැකි ප්‍රවේණික DNA මුදාහරිමින් ශාක පටක විනාශ කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරයි.කාලය කෙටි කිරීම හෝ උෂ්ණත්වය අඩු නොකරන්න.
බී.එය ප්‍රාථමික Tm අගයට සමානව හෝ Tm අගයට වඩා 2 ~ 4℃ ඉහළට සැකසීම නිර්දේශ කෙරේ.මෙම නිෂ්පාදනයේ භාවිතා වන සෘජු විස්තාරණ DNA පොලිමරේස් සාම්ප්‍රදායික Taq DNA පොලිමරේස් වලට වඩා වෙනස් වන අතර ප්රතික්රියා නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය සඳහා විශේෂ අවශ්‍යතා ඇත; ඉහළ නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය භාවිතා කිරීමෙන් නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය ඵලදායී ලෙස අඩු කර විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි දියුණු කළ හැකිය.සංකීර්ණ සැකිලි සඳහා, උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය සකස් කිරීම සහ දිගු කිරීමේ කාලය දිගු කිරීම මගින් කාර්යක්ෂම විස්තාරණය ලබා ගත හැක.
c.වර්ධක නිෂ්පාදනයේ දිග ≤1 kb නම්, දිගු කාලය තත්පර 30/kb ලෙස සකසා ඇත;විස්තාරණ නිෂ්පාදනයේ දිග >1 kb නම්, දිගු කාලය තත්පර 60/kb ලෙස සකසා ඇත.
ඈඅඩු විස්තාරණ අස්වැන්නක් සහිත සංකීර්ණ සාම්පල හෝ සාම්පල සඳහා, චක්‍ර ගණන චක්‍ර 40 -50 දක්වා උචිත ලෙස වැඩි කළ හැක.
අයදුම්පත්
එය ශාක පටක සෘජුව විස්තාරණය කිරීම සහ පොලිසැකරයිඩ සහ පොලිෆෙනෝල් අඩංගු නොවන ශාක සාම්පලවල අධි-නිශ්පාදන පිරික්සීම සඳහා අදාළ වේ.
සටහන්
පර්යේෂණ භාවිතය සඳහා පමණි.රෝග විනිශ්චය ක්‍රියා පටිපාටිවල භාවිතය සඳහා නොවේ.
1. බොරතෙල් ශාක විස්තාරණය හෝ සෘජු විස්තාරණය සඳහා, පද්ධතිය, ප්‍රයිමර් සහ මෙහෙයුම් නිවැරදි බව සහතික කිරීම සඳහා අත්හදා බැලීම ආරම්භ කිරීමට පෙර ධනාත්මක පාලනයක් ලෙස පිරිසිදු කරන ලද ප්‍රවේණික DNA භාවිතා කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.
2. මෙම කට්ටලයේ භාවිතා කරන සෘජු විස්තාරණ DNA පොලිමරේස් ශක්තිමත් සෝදුපත් කියවීමේ ක්‍රියාකාරකම් ඇත.TA ක්ලෝනකරණය සිදු කළ යුතු නම්, ඇඩිනීන් එකතු කිරීමට පෙර DNA පිරිසිදු කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.
3. ප්‍රයිමර් නිර්මාණ මාර්ගෝපදේශය
ඒ.ප්‍රාථමිකයේ 3′ අන්තයේ අවසාන පාදය G හෝ C විය යුතු බව නිර්දේශ කෙරේ.
බී.ප්‍රාථමිකයේ 3′ අන්තයේ ඇති අවසාන පාද 8 තුළ අඛණ්ඩ නොගැලපීම් වැළැක්විය යුතුය.c.ප්‍රයිමරයේ 3′ කෙළවරේ කෙස් කටු ව්‍යුහවලින් වළකින්න.
ඈඉදිරි ප්‍රාථමිකයේ සහ ප්‍රතිලෝම ප්‍රාථමිකයේ Tm අගයෙහි වෙනස්කම් 1℃ ට නොවැඩි විය යුතු අතර Tm අගය 60 ~ 72℃ ලෙස සකස් කළ යුතුය (Tm අගය ගණනය කිරීමට ප්‍රයිමර් ප්‍රිමියර් 5 නිර්දේශ කෙරේ).
ඊ.ප්‍රාථමික Tm අගය ගණනය කිරීමේදී අච්චුව සමඟ නොගැලපෙන අමතර අමතර ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙලවල් ඇතුළත් නොකළ යුතුය.
f.ප්‍රයිමරයේ GC අන්තර්ගතය 40% -60% වීම නිර්දේශ කෙරේ.
g.ප්‍රාථමිකයේ A, G, C සහ T හි සමස්ත ව්‍යාප්තිය හැකි තරම් සමාන විය යුතුය.ඉහළ GC හෝ AT අන්තර්ගතයන් සහිත කලාප භාවිතා කිරීමෙන් වළකින්න.
h.ප්‍රාථමිකය තුළ හෝ ප්‍රාථමික දෙකක් අතර අනුපූරක අනුපිළිවෙලවල් 5ක් හෝ වැඩි ගණනක් පැවතීම වළක්වන්න සහ ප්‍රයිමර් දෙකක 3′ අන්තයේ පාද 3ක් හෝ වැඩි ගණනක අනුපූරක අනුපිළිවෙලක් තිබීමෙන් වළකින්න.
මම.නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය වැළැක්වීම සඳහා ප්‍රාථමිකයේ විශේෂත්වය පරීක්ෂා කිරීමට NCBI BLAST ශ්‍රිතය භාවිතා කරන්න.
