M-MLV ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම
RevScript Reverse transcriptase ලබා ගන්නේ ජාන ඉංජිනේරු තාක්ෂණය මගිනි.එය ඉහළ cDNA සංශ්ලේෂණ හැකියාව, තාප ස්ථායීතාවය සහ ප්රතික්රියා උෂ්ණත්ව සීමාව (60 ° C දක්වා) ඇත.සංස්ලේෂණය කරන ලද cDNA නිෂ්පාදනය 10 kb දක්වා වේ.එය සැකිලිවල බැඳීම වැඩි දියුණු කරන අතර සංකීර්ණ ද්විතියික ව්‍යුහයක් හෝ අඩු පිටපත් ජාන සහිත RNA සැකිලි ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා සුදුසු වේ.
සංරචක
| සංරචකය | HC2003 බී-01 (U10,000U) | HC2003 බී-02 (5*10,000U) | HC2003 බී-03 (200,000U) |
| RevScript Reverse Transscriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 මිලි |
| 5 × RevScript බෆරය | 250 μL | 1.25 මිලි | 5 මිලි |
ගබඩා තත්ත්වය
මෙම නිෂ්පාදනය වසර 2 ක් සඳහා -25 ° C~-15 ° C දී ගබඩා කළ යුතුය.
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
එක් ඒකකයක් Oligo(dT) ප්‍රයිමර් ලෙස භාවිතා කරමින් 37°C දී විනාඩි 10කින් අම්ල-ද්‍රාව්‍ය නොවන ද්රව්ය බවට dTTP 1 nmol ඇතුළත් කරයි.
ප්රතික්රියා සැකසුම
1.RNA සැකිල්ලේ Denaturation (මෙම පියවර විකල්ප වේ, RNA අච්චුව denaturation කිරීම ද්විතියික ව්‍යුහයන් විවෘත කිරීමට උපකාරී වේ, එය පළමු කෙඳි cDNA අස්වැන්න වැඩි දියුණු කරයි.)
| සංරචක | පරිමාව (μL) |
| RNase නිදහස් ddH2O | 13 දක්වා |
| ඔලිගෝ(dT)18 (50 μmol/L) හෝ සසම්භාවී ප්‍රයිමර් (50 μmol/L) හෝ ජාන විශේෂිත ප්‍රයිමර් (2 μmol/L) | 1 |
| හෝ 1 | |
| හෝ 1 | |
| RNA සැකිල්ල | xa |
සටහන්:
1) a: මුළු RNA: 1-5 ug හෝ mRNA: 1-500 ng
2) මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 65 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම, පසුව විනාඩි 2 ක් සිසිල් කිරීම සඳහා වහාම අයිස් මත මාරු කිරීම.ප්රතික්රියා ද්‍රව එකතු කිරීම සඳහා කෙටි කේන්ද්‍රාපසාරණය, පහත වගුවේ පෙන්වා ඇති පරිදි ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්රතික්රියා විසඳුම එක් කරන්න.මිශ්ර කිරීමට මෘදු පයිප්ප.
1.ප්රතික්රියා මිශ්රණය සකස් කිරීම (20 μL පරිමාව)
| සංරචක | පරිමාව (μL) |
| පෙර පියවරේ මිශ්රණය | 13 |
| 5 × බෆරය | 4 |
| dNTP මිශ්රණය (10nmol/L) | 1 |
| ප්‍රතිලෝම පිටපත (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.පහත සඳහන් කොන්දේසි යටතේ ප්රතික්රියාව සිදු කරන්න:
| උෂ්ණත්වය (°C) | කාලය |
| 25 °Ca | විනාඩි 5 |
| 42 °Cb | විනාඩි 15-30 |
| 85 °Cc | විනාඩි 5 |
සටහන්:
1) a.සසම්භාවී හෙක්සැමර් භාවිතා කිරීම සඳහා පමණක් විනාඩි 5 ක් සඳහා 25 ° C දී ඉන්කියුබේට් කිරීම අවශ්ය වේ.Oligo (dT) භාවිතා කරන විට කරුණාකර මෙම පියවර මඟ හරින්න18හෝ Gene Specific Primer.
2) ආ.නිර්දේශිත ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ උෂ්ණත්වය 42°C වේ, සංකීර්ණ ද්විතියික ව්‍යුහයන් හෝ ඉහළ GC අන්තර්ගතයක් සහිත සැකිලි සඳහා, ප්රතික්රියා උෂ්ණත්වය 50-55°C දක්වා ඉහළ නැංවීම නිර්දේශ කෙරේ.
3) ඇ.ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් අක්‍රිය කිරීමට මිනිත්තු 5ක් සඳහා 85°C රත් කිරීම.
4) නිෂ්පාදනය සෘජුවම PCR හෝ qPCR ප්රතික්රියා වලදී භාවිතා කළ හැක, නැතහොත් කෙටි කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා -20 ° C දී ගබඩා කළ හැක.දිගු කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා නිෂ්පාදන ඇලිගුට් කිරීම සහ -80 ° C දී ගබඩා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.නිතර කැටි ගැසීමෙන් වළකින්න.
5) නිෂ්පාදිතය එක්-පියවර RT-qPCR සඳහා සුදුසු වේ, සෑම 25μL ප්රතික්රියා පද්ධතියක් සඳහා 10-20 U ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් එකතු කිරීම හෝ සත්‍ය තත්ත්වයට අනුව ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රමාණය ක්‍රමයෙන් වැඩි කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.
සටහන්
1.කරුණාකර පර්යේෂණාත්මක ප්‍රදේශය පිරිසිදුව තබා ගන්න;මෙහෙයුම අතරතුර පිරිසිදු අත්වැසුම් සහ මුහුණු ආවරණ පැළඳිය යුතුය.RNase දූෂණය වැළැක්වීම සඳහා අත්හදා බැලීමේ දී භාවිතා කරන සියලුම පරිභෝජන ද්රව්ය RNase නිදහස් විය යුතුය.
2.ආර්එන්ඒ ක්ෂය වීම වැළැක්වීම සඳහා සියලුම ක්‍රියා පටිපාටි අයිස් මත සිදු කළ යුතුය.
3.ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ඉහළ කාර්යක්ෂමතාව සහතික කිරීම සඳහා උසස් තත්ත්වයේ RNA සාම්පල නිර්දේශ කෙරේ.
4.මෙම නිෂ්පාදනය පර්යේෂණ භාවිතය සඳහා පමණි.
5. කරුණාකර ඔබේ ආරක්ෂාව සඳහා රසායනාගාර කබා සහ ඉවත දැමිය හැකි අත්වැසුම් සමඟ ක්‍රියා කරන්න.
