M-MLV Neoscript Reverse Transscriptase
Neoscript Reverse Transcriptase යනු Moloney murine leukemia වෛරස් සම්භවය සහ E.coli හි ප්‍රකාශනයේ M-MLV ජානයේ විකෘති පරීක්ෂාව මගින් ලබාගත් ප්රතිලෝම පිටපතකි.එන්සයිම RNase H ක්‍රියාකාරකම් ඉවත් කරයි, ඉහළ උෂ්ණත්ව ඉවසීමක් ඇති අතර ඉහළ උෂ්ණත්ව ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා සුදුසු වේ.එබැවින්, එය RNA ඉහළ මට්ටමේ ව්‍යුහයේ අහිතකර බලපෑම් සහ cDNA සංස්ලේෂණය මත විශේෂිත නොවන සාධක ඉවත් කිරීම සඳහා උපකාරී වන අතර ඉහළ ස්ථායීතාවයක් සහ ප්‍රතිවර්තන සංස්ලේෂණ හැකියාවක් ඇත.එන්සයිමයට ඉහළ ස්ථායීතාවයක් සහ ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ සංශ්ලේෂණ හැකියාවක් ඇත.
සංරචක
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transscriptase
2.5 × පළමු නූල් බෆරය (විකල්ප)
* 5 × පළමු නූල් බෆරයේ dNTP අඩංගු නොවේ, ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කිරීමේදී කරුණාකර dNTPs එක් කරන්න
නිර්දේශිත යෙදුම
1.එක්-පියවර qRT-PCR.
2.RNA වෛරස් හඳුනාගැනීම.
ගබඩා තත්ත්වය
දිගු කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා -20 ° C, භාවිතයට පෙර හොඳින් මිශ්ර කළ යුතුය, නිතර නිතර කැටි කිරීම වළක්වා ගන්න.
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
එක් ඒකකයක් poly(A)•oligo(dT) භාවිතයෙන් 37°C දී විනාඩි 10කින් dTTP 1 nmol අන්තර්ගත කරයි.25අච්චුව/ප්‍රාථමිකය ලෙස.
තත්ත්ව පාලනය
1.SDS-PAGE විද්යුත් විච්ඡේදක සංශුද්ධතාවය 98% ට වඩා වැඩිය.
2.විස්තාරණ සංවේදීතාව, කණ්ඩායමට කණ්ඩායමට පාලනය, ස්ථාවරත්වය.
3.බාහිර න්‍යෂ්ටික ක්‍රියාකාරකම් නැත, බාහිර එන්ඩොනියුක්ලීස් හෝ එක්සෝනියුක්ලීස් දූෂණය නොමැත
පළමු දාම ප්රතික්රියා විසඳුම සඳහා ප්රතික්රියා සැකසුම
1.ප්රතික්රියා මිශ්රණය සකස් කිරීම
| සංරචක | පරිමාව |
| ඔලිගෝ(dT)12-18 ප්‍රයිමර් හෝ Random Primerඒ නැතහොත් Gene Specific Primersb | ප.ව.50 |
| 50 pm (20-100 pmol) | |
| 2 ප.ව | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| සැකිල්ල RNA | මුළු RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-නිදහස් dH2O | 10 μL දක්වා |
සටහන්:a/b: කරුණාකර ඔබේ පර්යේෂණාත්මක අවශ්‍යතා අනුව විවිධ වර්ගයේ ප්‍රයිමර් තෝරන්න.
2.65°C දී විනාඩි 5ක් රත් කර විනාඩි 2ක් අයිස් මත වේගයෙන් සිසිල් කරන්න.
3.20µL සම්පූර්ණ පරිමාවකට ඉහත පද්ධතියට පහත සඳහන් සංරචක එකතු කර මෘදු ලෙස මිශ්ර කරන්න:
| සංරචක | පරිමාව (μL) |
| 5 × පළමු නූල් බෆරය | 4 |
| Neoscript Reverse Transscriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase-නිදහස් dH2O | 20 μL දක්වා |
4. කරුණාකර පහත කොන්දේසි අනුව ප්‍රතික්‍රියාව සිදු කරන්න:
(1) Random Primer භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රතික්‍රියාව විනාඩි 10ක් සඳහා 25℃ දී සිදු කළ යුතු අතර පසුව 50℃ 30 ~ 60mins;
(2) Oligo dT හෝ විශේෂිත ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රතික්‍රියාව විනාඩි 30 ~ 60 ක් සඳහා 50℃ දී සිදු කළ යුතුය.
5.නියෝස්ක්‍රිප්ට් ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් අක්‍රිය කිරීමට සහ ප්‍රතික්‍රියාව අවසන් කිරීමට මිනිත්තු 5ක් සඳහා 95℃ රත් කරන්න.
6.ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ නිෂ්පාදන සෘජුවම PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ සහ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR ප්‍රතික්‍රියාවේදී භාවිතා කළ හැක, නැතහොත් -20℃ දී දිගු කාලයක් ගබඩා කර තැබිය හැක.
PCR ආර්ක්‍රියාව:
1.ප්රතික්රියා මිශ්රණය සකස් කිරීම
| සංරචක | සමාධිය |
| 10 × PCR බෆරය (dNTP නොමිලේ, Mg²+ නොමිලේ) | 1× |
| dNTPs (10mM එක් dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 මි.මී |
| Taq DNA පොලිමරේස් (5U/μL) | 2-2.5 යූ |
| ප්‍රාථමික 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| ප්‍රයිමර් 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| සැකිල්ලඒ | ≤10% පළමු දාම ප්රතික්රියා විසඳුම (2 μL) |
| ddH2O | 50 μL දක්වා |
සටහන්:a: පළමු දාම ප්රතික්රියා විසඳුම ඕනෑවට වඩා එකතු කළහොත්, PCR ප්‍රතික්‍රියාව වැළැක්විය හැකිය.
2.PCR ප්රතික්රියා පටිපාටිය
| පියවර | උෂ්ණත්වය | කාලය | සයිකල් |
| පූර්ව නිරෝධනය | 95℃ | විනාඩි 2-5 | 1 |
| Denaturation | 95℃ | තත්පර 10-20 | 30-40 |
| නිර්වින්දනය | 50-60℃ | තත්පර 10-30 | |
| දිගු කිරීම | 72℃ | තත්පර 10-60 |
සටහන්
1.42℃~55℃ පරාසයක ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ උෂ්ණත්ව ප්‍රශස්තකරණය සඳහා සුදුසු වේ.
2.එය වඩා හොඳ ස්ථාවරත්වයක් ඇත, ඉහළ උෂ්ණත්ව ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ විස්තාරණය සඳහා සුදුසු වේ.මීට අමතරව, එය RNA හි සංකීර්ණ ව්‍යුහාත්මක කලාප හරහා කාර්යක්ෂමව ගමන් කිරීම සඳහා හිතකර වේ.එසේම, එයඑක්-පියවර මල්ටිප්ලෙක්ස් ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක RT-PCR හඳුනාගැනීම සඳහා සුදුසු වේ.
3.විවිධ PCR වර්ධක එන්සයිම සමඟ හොඳ ගැළපීමක් සහ ඉහළ සංවේදී RT-PCR ප්රතික්රියා සඳහා සුදුසු වේ.
4.ඉහළ සංවේදීතාවයේ එක්-පියවර ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක RT-PCR ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා සුදුසුය, සැකිලිවල අඩු සාන්ද්‍රණය හඳුනාගැනීමේ වේගය ඵලදායී ලෙස වැඩි දියුණු කරයි.
5.cDNA පුස්තකාල ඉදිකිරීම සඳහා සුදුසු වේ.
