බහුකාර්ය එක් පියවර RT-qPCR පූර්ව මිශ්‍රණය-UNG (එක්-නලයක්)
බහුකාර්ය එක් පියවර RT-qPCR පූර්ව මිශ්‍රණය-UNG (එක්-නල) යනු එක්-පියවර ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ ප්‍රමාණාත්මක PCR (qRT-PCR) සඳහා සුදුසු ඉතා ස්ථායී එක්-නල පරීක්ෂණ-පාදක මිශ්‍රණයකි. එය ප්‍රයිමර් සහ පරීක්ෂණ පූර්ව මිශ්‍ර කිරීමට සහය දක්වන අතර අඩු උෂ්ණත්වයකදී දිගු කාලයක් ගබඩා කිරීමෙන් පසු ස්ථායීව පවතී. පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය භාවිතා කරන විට සෘජුවම එකතු කළ හැකිය, අතිරේක නල විවෘත කිරීම/නල ක්‍රියාවලියකින් තොරව. මෙම නිෂ්පාදනය සංරචක සපයයි, උදා: උණුසුම්-ආරම්භක DNA පොලිමරේස්, M-MLV, තාප-ලේබල් යුරැසිල් DNA ග්ලයිකොසිලේස් (TS-UNG), RNase නිෂේධකය, MgCl2, dNTPs (dTTP වෙනුවට dUTP සමඟ) සහ ස්ථායීකාරක. ජානමය වශයෙන් වෙනස් කරන ලද වේගවත් විස්තාරණ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ DNA පොලිමරේස් සමඟ, PCR විස්තාරණය මිනිත්තු 20~40ක් ඇතුළත සම්පූර්ණ කළ හැකිය. මෙම ප්‍රතික්‍රියාකාරකය ප්‍රති-නිෂේධක විස්තාරණ එන්සයිම සහ UNG එන්සයිම මිශ්‍ර එන්සයිම සමඟ qPCR සඳහා විශේෂ බෆරයක් භාවිතා කරයි. එම නිසා, එය ඉලක්කගත ජානවල හොඳ විස්තාරණයක් ලබා ගත හැකි අතර PCR අවශේෂ සහ aerosol දූෂණය නිසා ඇතිවන ව්‍යාජ විස්තාරණය වළක්වා ගත හැකිය. මෙම ප්‍රතික්‍රියාකාරකය Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad සහ Roche වැනි නිෂ්පාදකයින්ගේ බොහෝ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR උපකරණ සමඟ අනුකූල වේ.
සංරචක
1. 25×Neoscript වේගවත් RTase/UNG මිශ්‍රණය
2. 5× නියෝස්ක්‍රිප්ට් වේගවත් RT ප්‍රීමික්ස් බෆරය (dUTP)
ගබඩා කොන්දේසි
සියලුම සංරචක දිගු කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා -20℃ සහ මාස 3ක් දක්වා 4℃ උෂ්ණත්වයක තබා ගත යුතුය. කරුණාකර දියවීමෙන් පසු හොඳින් මිශ්‍ර කර භාවිතා කිරීමට පෙර කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න. නිතර කැටි කිරීමෙන් වළකින්න.
පාපැදි ප්‍රොටෝකෝලය
| සංයුතිය | පරිමාව එක් ප්රතික්රියාව | පරිමාව එක් ප්රතික්රියාව | අවසන් සාන්ද්‍රණය |
| 5 × නියෝස්ක්‍රිප්ට් වේගවත් RT ප්‍රීමික්ස් බෆරය (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1 × |
| 25×NeoscriptFast RTase/UNG මිශ්‍රණය | 1 μL | 2 μL | 1 × |
| 25 × ප්‍රයිමර්-ප්‍රොබ් මිශ්‍රණය 1,2 | 1 μL | 2 μL | 1 × |
| RNA 3 සැකිල්ල | —— | —— | —— |
| ඩීඩීඑච්2ඕ | 25 µL දක්වා | 50 μL දක්වා | —— |
1. ප්‍රයිමරයේ අවසාන සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් 0.2 μM වේ. වඩා හොඳ ප්‍රතිඵල සඳහා, ප්‍රයිමර් සාන්ද්‍රණය 0.2~1 μM පරාසය තුළ ප්‍රශස්තිකරණය කළ හැක. සාමාන්‍යයෙන්, පරීක්ෂණ සාන්ද්‍රණය 0.1~0.3 μM පරාසය තුළ ප්‍රශස්තිකරණය කළ හැක.
2. වේගවත් PCR ක්රියා පටිපාටියක් භාවිතා කරන විට, ප්‍රයිමර් සහ පරීක්ෂණවල සාන්ද්‍රණය වැඩි කිරීමෙන් වඩා හොඳ විස්තාරණ ප්‍රතිඵල ලබා ගත හැකි අතර, ඒවායේ අනුපාතය ඒ අනුව ප්‍රශස්ත කළ යුතුය.
3. විවිධ වර්ගයේ සැකිලි වල ඉලක්ක ජානවල විවිධ පිටපත් සංඛ්‍යා අඩංගු වන අතර, ප්‍රශස්ත සැකිලි එකතු කිරීම තීරණය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය නම් අනුක්‍රමික තනුක කිරීම සිදු කළ හැක.
ප්‍රතික්‍රියා කොන්දේසි
| සාමාන්‍ය PCR | වේගවත් PCR | |||||
| ක්රියා පටිපාටිය | උෂ්ණත්වය. | කාලය | සයිකල් | උෂ්ණත්වය. | කාලය | සයිකල් |
| ආපසු හැරවීම පිටපත් කිරීම | 50℃ උෂ්ණත්වය | විනාඩි 10~20 | 1 | 50℃ උෂ්ණත්වය | විනාඩි 5 | 1 |
| පොලිමරේස් සක්‍රිය කිරීම | 95℃ උෂ්ණත්වය | මිනිත්තු 1~5 | 1 | 95℃ උෂ්ණත්වය | තත්පර 30 යි | 1 |
| ප්‍රතිසන්ධිකරණය | 95℃ උෂ්ණත්වය | තත්පර 10~20 |
40~50 | 95℃ උෂ්ණත්වය | තත්පර 1~3 |
40~45 |
| ඇනීලිං සහ දිගු කිරීම | 56~64℃ | තත්පර 20~60 | 56~64℃ | තත්පර 3~20 | ||
තත්ත්ව පාලනය
1. ක්‍රියාකාරීත්වය හඳුනාගැනීම: qRT-PCR හි සංවේදීතාව, නිශ්චිතභාවය සහ පුනරාවර්තන හැකියාව.
2. බාහිර නියුක්ලීස් ක්‍රියාකාරිත්වයක් නොමැත: බාහිර එන්ඩොනියුක්ලීස් සහ එක්සොනියුක්ලීස් දූෂණයක් නොමැත.
තාක්ෂණික තොරතුරුආර්මේෂන්
1. වේගවත් DNA පොලිමරේස් වල විස්තාරණ අනුපාතය 1kb/10s ට නොඅඩු වේ. විවිධ PCR උපකරණවලට විවිධ තාපන සහ සිසිලන වේගයන්, උෂ්ණත්ව පාලන ක්‍රම සහ තාප සන්නායකතාවය ඇත, එබැවින් ඔබේ ප්‍රයිමර්/පරීක්ෂණ සාන්ද්‍රණය සහ ධාවන ක්‍රමය ඔබේ නිශ්චිත වේගවත් PCR උපකරණය සමඟ ඒකාබද්ධව ප්‍රශස්ත කිරීම අත්‍යවශ්‍ය වේ.
2. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාලය විස්තාරණය කළ යුතු කොටසේ දිග අනුව ප්‍රශස්ත කර ඇති අතර, දිගු කොටස මඟින් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාලය සුදුසු පරිදි දීර්ඝ කළ හැකිය.
3. මෙම නිෂ්පාදනය පුළුල් ලෙස අදාළ වන අතර, එය ඉහළ සංවේදී අණුක රෝග විනිශ්චය සඳහා සුදුසු වේ.
4. අඩු ඇනීලිං උෂ්ණත්වයක් සහිත ප්‍රයිමර් සඳහා හෝ 200 bp ට වැඩි දිගු කොටස් විස්තාරණය කිරීම සඳහා තුන්-පියවර PCR ක්‍රමය නිර්දේශ කෙරේ.
5. විවිධ ඇම්ප්ලිකන් dUTP හි විවිධ උපයෝගිතා කාර්යක්ෂමතාව සහ UNG සඳහා විවිධ සංවේදීතාව ඇති බැවින්, UNG පද්ධතිය භාවිතා කරන විට හඳුනාගැනීමේ සංවේදීතාව අඩු වුවහොත් ප්‍රතික්‍රියාකාරක ප්‍රශස්ත කළ යුතුය. අවශ්‍ය නම් තාක්ෂණික සහාය සඳහා කරුණාකර අප හා සම්බන්ධ වන්න.
6. රැගෙන යන PCR නිෂ්පාදනවල විස්තාරණය වැළැක්වීම සඳහා, විස්තාරණය සඳහා කැපවූ පර්යේෂණාත්මක ප්‍රදේශයක් සහ පයිප්පයක් අවශ්‍ය වේ. අත්වැසුම් සමඟ ක්රියා කර නිතර මාරු කරන්න, විස්තාරණයෙන් පසු PCR නළය විවෘත නොකරන්න.
