Dnase පරීක්ෂණ කට්ටලය (ප්‍රතිදීප්ත)
DNase හඳුනාගැනීමේ කට්ටලය ෆ්ලෝරෝෆෝර් ලේබල් කරන ලද DNA පරීක්ෂණයක් මත පදනම් වේ. නියැදියේ DNase ක්‍රියාකාරකම් අඩංගු නොවන විට, පරීක්ෂණය ස්ථායී වන අතර ප්‍රතිදීප්ත සංඥාවක් නිපදවන්නේ නැත; නියැදියේ DNase ක්‍රියාකාරකම් අඩංගු වන විට, පරීක්ෂණය පිරිහී යන අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ක්‍රමයෙන් වැඩි දියුණු කරන ලද ප්‍රතිදීප්ත සංඥාවක් ඇති වේ; ප්‍රතිදීප්ත සංඥාවේ වැඩිවීමේ වේගය එන්සයිම ගණන සහ ක්‍රියාකාරිත්වය සමඟ ධනාත්මකව සහසම්බන්ධ වේ. නියැදිය DNase මගින් දූෂිත වී ඇත්දැයි තීරණය කිරීම සඳහා ex/em=485/525nm තරංග ආයාමයෙන් මැනීමට ප්‍රතිදීප්ත ක්ෂුද්‍ර තහඩු කියවනයක් භාවිතා කරන්න.
අයදුම්පත
මෙම කට්ටලය සාම්පලවල DNase දූෂණය හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරයි.
චවිරුද්ධවාදීන්
| නම | HCP0034A-01 හඳුන්වා දීම (192ටී) | HCP0034A-02 හඳුන්වා දීම (ට 48) |
| 10×ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණය | 2.0මිලි | 0.5මිලි |
| DNA පරීක්ෂණය | 1ටියුබ් | 1ටියුබ් |
| TE බෆරය | 2.0මිලි | 0.5මිලි |
| DNase I ප්‍රමිතිය (2U/μL) | 20μL | 10μL |
| සම්මත තනුක බෆරය | මිලි ලීටර් 12 | 6 මිලි |
| DNase&RNase-නිදහස් ජලය | මිලි ලීටර් 25 | මිලි ලීටර් 25 |
| DNase RNase ඉවතට | 50 මිලි | 50 මිලි |
ගබඩා කිරීම සහ ස්ථාවරත්වය
1.-25 ~ – 15 ℃ තුළ ප්‍රවාහනය කෙරේ;
2.කට්ටලයේ විවිධ සංරචක උෂ්ණත්වය අනුව වෙන වෙනම ගබඩා කර ඇත:
| නම | උෂ්ණත්වය |
| 10×ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණය | -25 ~ – 15℃ |
| DNA පරීක්ෂණය | -25 ~ – 15℃ |
| TE බෆරය | -25 ~ – 15℃ |
| DNase I ප්‍රමිතිය (2U/μL) | -25 ~ – 15℃ |
| සම්මත තනුක බෆරය | -25 ~ – 15℃ |
| DNase&RNase-නිදහස් ජලය | -25 ~ 30℃ |
| DNase RNase ඉවතට | 2 ~ 30℃ |
1. විවෘත නොකළ කට්ටලය මාස 12ක් ගබඩා කරන්න.
2.කට්ටලය විවෘත කිරීමෙන් පසු මාස 6 ක් ගබඩා කරන්න. ආලෝකය සහ නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම වළක්වා ගැනීම සඳහා DNA පරීක්ෂණ ද්‍රාවණය තනි භාවිත ප්‍රමාණයට අනුව ආදේශ කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.
අවශ්‍ය උපකරණ සහ පරිභෝජන ද්‍රව්‍ය
1.ප්‍රතිදීප්ත ක්ෂුද්‍ර තහඩු කියවනය (ex/em=485/525nm තරංග ආයාමය ඇතුළුව)
2.DNase&RNase-නිදහස් පයිප්ප සහ ඉඟි
3.DNase&RNase-නිදහස් EP නළය
4.DNase&RNase-නිදහස් කළු විනිවිද නොපෙනෙන 96-ළිං තහඩුව
ප්‍රතික්‍රියාකාරක සකස් කිරීම
1.කට්ටලය පිටතට ගෙන කාමර උෂ්ණත්වයට (18~25℃) සමතුලිත කරන්න, 10× ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණය, TE බෆරය, DNase I ප්‍රමිතිය (2U/μL), සම්මත තනුක බෆරය වැනි සංරචක සොලවා මිශ්‍ර කරන්න, ඉන්පසු වහාම කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න. (තත්පර 10 ක් සඳහා 4000~7000rpm හි කේන්ද්‍රාපසාරී).
2.DNA පරීක්ෂණය 4000~7000rpm හිදී තත්පර 60ක් කේන්ද්‍රාපසාරී කර, නලයේ පතුලට එකතු කර, නල පියන ප්‍රවේශමෙන් විවෘත කර, DNA පරීක්ෂණ ගබඩා ද්‍රාවණය ලෙස විසුරුවා හැරීමට 40μL TE බෆරයක් එක් කරන්න, තනි භාවිත ප්‍රමාණයට අනුව DNA පරීක්ෂණ ගබඩා ද්‍රාවණය අඩු කර නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම වළක්වා ගැනීම සඳහා ඒවා -25 ~ -15 °C හි ගබඩා කරන්න. ඔබ පරීක්ෂා කරන සෑම අවස්ථාවකම පරීක්ෂණ ගබඩා ද්‍රාවණය පිටතට ගෙන, DNA පරීක්ෂණ ක්‍රියාකාරී ද්‍රාවණය ලෙස TE බෆරය සමඟ 50 වතාවක් තනුක කරන්න (උදාහරණයක් ලෙස, 12μL DNA පරීක්ෂණ ද්‍රාවණයට 490μL TE බෆරයක් එක් කරන්න). ආලෝකය සහ නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම වළක්වා ගැනීම සඳහා ඉතිරි DNA පරීක්ෂණ ක්‍රියාකාරී ද්‍රාවණය -25 ~ -15 °C හි ගබඩා කරන්න.
හඳුනාගැනීමේ පියවර
1.සංවේදීතාව නැතිවීමේ හෝ සංඥා අධික සන්තෘප්තියේ අවදානම වළක්වා ගැනීම සඳහා පළමු පරීක්ෂණයට පෙර සුදුසු ලාභයක් සැකසීමට පියවර ගන්න.
1) උපකරණ පරාමිතීන්:
හඳුනා ගැනීමට පෙර තත්පර 10 ~ 15 ක් තහඩුව සෙලවීම;
උද්දීපන තරංග ආයාමය λEx=485nm;
විමෝචන තරංග ආයාමය λEm=525nm;
ස්වයංක්‍රීය ලාභ ශ්‍රිතය භාවිතා කරන්න;
උෂ්ණත්වය 37℃;
අන්ත ලක්ෂ්‍ය ප්‍රකාරය.
හැකි නම් ලාභය ස්වයංක්‍රීය පරිමාණයට සකසන්න, විකල්පයක් ලෙස මුලින් මධ්‍යම ලාභ සැකසුමක් භාවිතා කරන්න.
සටහන: විවිධ උපකරණවල සැකසුම් ක්‍රමය අනුකූල නොවේ, කරුණාකර විස්තර සඳහා උපකරණ සැපයුම්කරුගෙන් විමසන්න.
2) ළිං 96 තහඩුවක ළිං 2ක් තෝරා, එක් එක් ළිඳට 10μL DNA පරීක්ෂණ ක්‍රියාකාරී ද්‍රාවණයක් සහ 10μL 10× ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණයක් එක් කරන්න;
3) එක් ළිඳකට DNase&RNase-නිදහස් ජලය 80μL එකතු කරන්න, සහ අනෙක් ළිඳට DNase&RNase-නිදහස් ජලය 79μL සහ DNase I සම්මත (2U/μL) 1μL එකතු කරන්න.
4) තහඩුව 37°C දී අඳුරු ස්ථානයක තබා විනාඩි 30 කට පසු එය පරීක්ෂා කරන්න.
5) ලාභය ස්වයංක්‍රීය පරිමාණයට සකසා ඇත්නම්, ලාභ අගය දත්ත ගොනුවේ උපකරණ පරාමිති තීරුවේ පෙන්වනු ඇත, එය G1 ලෙස දැක්වේ.
6) මුලින් මධ්‍යම ලාභ සැකසුමක් භාවිතා කරන විට, පහත සඳහන් කරුණු සැලකිල්ලට ගත යුතුය: ඉහළ ප්‍රතිදීප්ත අගය උපකරණයේ ඉහළ සීමාව ඉක්මවා ගියහොත්, ලාභ අගය සුදුසු පරිදි අඩු කළ යුතුය; ඉහළ ප්‍රතිදීප්ත අගය උපකරණයේ ඉහළ සීමාවට වඩා බෙහෙවින් අඩු නම්, ලාභ අගය සුදුසු පරිදි වැඩි කළ යුතුය; අවසාන වශයෙන්, සුදුසු ලාභ අගය ලබා ගන්නා අතර එය G2 ලෙස දැක්වේ.
2.උපකරණ පරාමිතීන් සකසන්න:
හඳුනා ගැනීමට පෙර තත්පර 10 ~ 15 ක් තහඩුව සෙලවීම;
උද්දීපන තරංග ආයාමය λEx=485nm;
විමෝචන තරංග ආයාමය λEm=525nm;
පළමු පියවරේදී ලබාගත් ලාභ අගය G1 හෝ G2 ලෙස සකසන්න;
උෂ්ණත්වය 37℃;
ක්ෂුද්‍ර තහඩු කියවනය චාලක මාදිලියට සහය දක්වන්නේ නම්, මිනිත්තු 1 සිට 1.5 දක්වා පරතරයක් සහිතව චාලක හඳුනාගැනීමේ මාදිලිය භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලබන අතර, මුළු කාලය මිනිත්තු 30 කි.
3.නියැදි සකස් කිරීම
නිර්දේශිත සාම්පල පරිමාව 80μL වේ. පරීක්ෂා කළ යුතු සාම්පලය 80μL ට වඩා අඩු නම්, DNase&RNase-නිදහස් ජලය සමග 80μL දක්වා තනුක කරන්න.
පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත සාම්පලයේ ෆ්ලෝරෝෆෝරයේ දීප්තියට බලපාන ද්‍රව්‍ය (අඳුරු ද්‍රාවණ, ඉහළ සාන්ද්‍රණ දුස්ස්රාවී ද්‍රව්‍ය හෝ මතුපිට ද්‍රව්‍ය වැනි) අඩංගු වන විට, නියැදිය DNase&RNase-නිදහස් ජලයෙන් තනුක කළ යුතුය, නමුත් තනුක කිරීමේ ක්‍රියාවලිය සංවේදීතාවයට බලපාන බව කරුණාවෙන් සලකන්න. DNase ක්‍රියාකාරකම් නිෂේධක (ඉහළ අයනික ශක්තිය ද්‍රාවණ, pH9 බෆර, ප්‍රෝටීන් denaturants ආදිය) අඩංගු පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත සාම්පලය සඳහා, මිනුම් ප්‍රතිඵලය වන්නේ නියැදි ද්‍රාවණයේ සමස්ත එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය මිස එන්සයිමයේ තනි ක්‍රියාකාරිත්වය නොවේ.
DNase I ප්‍රමිතිය (2U/μL) පහත පරිදි සම්මත තනුක බෆරය සමඟ තනුක කරන්න:
| නැත. | සකස් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය | සාන්ද්‍රණය |
| 1 | 2μL DNase I සම්මත + 198μL සම්මත තනුක බෆරය | 2×10-2U/μL |
| 2 | 2μL අංක 1 සාම්පලය + 198μL සම්මත තනුක බෆරය | 2×10-4U/μL |
අංක 2 සාම්පලය DNase සහ RNase-නිදහස් ජලයෙන් 10 වතාවක් තනුක කරන්න:
| 3 යි | 20μL අංක 2 සාම්පලය + 180μL DNase සහ RNase-නිදහස් ජලය | 2×10-5U/μL |
අංක 3 සාම්පලය ධනාත්මක පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරයි; DNase&RNase-නිදහස් ජලය සෘණ පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරයි.
- මාත්‍රාව සහ පරීක්ෂාව
1) ළිං 96 තහඩුවට 10μL DNA පරීක්ෂණ ක්‍රියාකාරී ද්‍රාවණයක් සහ 10μL 10×ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණයක් එක් කරන්න. සෘණ පාලනය සහ ධනාත්මක පාලනය පිළිවෙලින් එකතු කිරීමට ළිං 4ක් සහ පරීක්ෂා කිරීමට සාම්පල එකතු කිරීමට අනෙක් ළිං තෝරන්න. සෑම සාම්පලයක් සඳහාම බහු ළිං 2ක්, එක් එක් ළිඳ සඳහා 80μL බැගින් ඇත;
2) වහාම ප්‍රතිදීප්ත සංඥා අගය RFU0 විනාඩි 0ක් පරීක්ෂා කර කියවන්න. 37 ℃ දී අඳුරේ විනාඩි 30ක් තැබූ පසු, නැවත විනාඩි 30ක් සඳහා ප්‍රතිදීප්ත සංඥා අගය RFU30 පරීක්ෂා කර කියවන්න. ගතික මාදිලිය අනුගමනය කරන්නේ නම්, 0~30min සඳහා සියලුම ප්‍රතිදීප්ත සංඥා කියවිය හැකිය.
පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵල අර්ථ නිරූපණය
RFU30≥2×RFU0 නම්, පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත නියැදිය DNase මගින් දූෂිත වී ඇති බව සලකනු ලැබේ.
සටහන: පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය බරපතල ලෙස දූෂිත වී ඇත්නම් හෝ බාධා කරන ද්‍රව්‍ය අඩංගු නම්, RFU0 (පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය) > RFU0 (ධනාත්මක තත්ත්ව පාලනය) සහ RFU30 (පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය)
ප්‍රමාණාත්මක අනාවරණය
පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත නියැදිය දූෂිත වී ඇති විට සහ නියැදියේ DNase සාන්ද්‍රණ අගය විනිශ්චය කිරීම අවශ්‍ය වූ විට, එය පහත ක්‍රියා පටිපාටි හරහා තීරණය කළ හැකිය:
DNase I ප්‍රමිතිය (2U/μL) පහත පරිදි සම්මත තනුක බෆරය සමඟ තනුක කරන්න:
| නැත. | සකස් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය | සාන්ද්‍රණය |
| 1 | 2μL DNase I සම්මත +198μL සම්මත තනුක බෆරය | 2×10-2U/μL |
| 2 | 2μL අංක 1 සාම්පලය +198μL සම්මත තනුක බෆරය | 2×10-4U/μL |
| 3 යි | 100μL අංක 2 සාම්පලය+100μL සම්මත තනුක බෆරය | 1×10-4U/μL |
| 4 | 100μL අංක 3 සාම්පලය+100μL සම්මත තනුක බෆරය | 5×10-5U/μL |
| 5 | 100μL අංක 4 සාම්පලය+100μL සම්මත තනුක බෆරය | 2.5×10-5U/μL |
| 6 | 100μL අංක 5 සාම්පලය+100μL සම්මත තනුක බෆරය | 1.25×10-5U/μL |
ඉන්පසු අංක 3 ~ අංක 5 සාම්පල DNase සහ RNase-නිදහස් ජලය සමග 10 වතාවක් තනුක කරන්න:
| 7 | 20μL අංකය 3 සාම්පල + 180μL DNase&RNase-නිදහස් ජලය | 1×10-5U/μL |
| 8 | 20μL අංකය 4 සාම්පල + 180μL DNase&RNase-නිදහස් ජලය | 5×10-6U/μL |
| 9 | 20μL අංකය 5 සාම්පල + 180μL DNase&RNase-නිදහස් ජලය | 2.5×10-6U/μL |
| 10 යි | 20μL අංකය 6 සාම්පල + 180μL DNase&RNase-නිදහස් ජලය | 1.25×10-6U/μL |
අංක 7 ~ අංක 10 සාම්පල ප්‍රමිති ලෙස භාවිතා කරයි; DNase සහ RNase-නිදහස් ජලය 0-සාන්ද්‍රණ සාම්පලයක් ලෙස.
RFU0 සහ RFU30 ලබා ගැනීම සඳහා හඳුනාගැනීමේ පියවරයන්ට අනුව 0-සාන්ද්‍රණ සාම්පලය, ප්‍රමිතීන් සහ දූෂිත නියැදිය එකට පරීක්ෂා කරන්න. ∆RFU = RFU30-RFU0 ගණනය කරන්න, ∆RFU (0 සාන්ද්‍රණය) සහ ∆RFU (සම්මතය) ඕඩිනේට් ලෙස ගන්න සහ සම්මතයේ DNase I සාන්ද්‍රණය abscissa ලෙස ගන්න (0 සාන්ද්‍රණය 0), රේඛීය සවි කිරීම සිදු කරන්න, සහ y = ax + B යන ගැළපෙන සමීකරණය ගණනය කරන්න, සහ සහසම්බන්ධතා සංගුණකය r ≥ 0.99 විය යුතුය. ∆RFU (දූෂිත නියැදිය) y ලෙස සමීකරණයට ගෙනැවිත්, x ගණනය කරන්න, සහ දූෂිත නියැදියේ ආසන්න සාන්ද්‍රණ අගය ලබා ගැනීම සඳහා නියැදියට පෙර තනුක ගුණයෙන් ගුණ කරන්න.
සටහන: උපකරණ සංඥාවේ උච්චාවචනය හේතුවෙන්, මෙම අවස්ථාවේදී ∆RFU
හඳුනාගැනීමේ කාර්ය සාධනය
1. හඳුනාගැනීමේ සීමාව：DNase I： 1.25×10-6U/μL
2.නිරවද්‍යතාවය: අභ්‍යන්තර කාණ්ඩ විචලන සංගුණකය ≤ 10%, අන්තර් කාණ්ඩ විචලන සංගුණකය ≤ 15%
අවධානය
1. නියැදි එකතු කිරීමේ ක්‍රියාවලිය හැකිතාක් වේගවත් විය යුතුය. ඕනෑවට වඩා දිගු කාලයක් අත්හදා බැලීමේ නිරවද්‍යතාවයට බලපානු ඇත.
2. විවිධ ප්‍රතිදීප්ත එන්සයිම ලේබල් කිරීමේ උපකරණවල පරාමිතීන් වෙනස් වේ. පළමු පරීක්ෂණයට පෙර සුදුසු ලාභය සකසන්න.
3. භාවිතයට පෙර සියලුම ප්‍රතික්‍රියාකාරක සම්පූර්ණයෙන්ම සොලවා ගත යුතුය. සාම්පල එකතු කරන විට, එකතු කරන ලද සාම්පල ළිං බිත්තියේ ඉහළ කොටසට එකතු වීම වැළැක්වීම සඳහා එන්සයිම ලේබල් තහඩුවේ පහළට එකතු කළ යුතුය. සාම්පල එකතු කරන විට, ඉසීමෙන් හෝ බුබුලු ජනනය නොකිරීමට අවධානය යොමු කරන්න.
4. කට්ටලයේ ප්‍රමිතිය DNase I වන අතර, එහි ක්‍රියාකාරී ඒකකය අර්ථ දක්වා ඇත්තේ DNase I ප්‍රතික්‍රියා බෆරයේ [1] 37°C දී මිනිත්තු 10 කින් pBR322 DNA 1 µg සම්පූර්ණයෙන්ම හායනයට ලක් කරන එන්සයිම ප්‍රමාණය ලෙසය. එක් DNase I ඒකකයක් 0.3 Kunitz ඒකකයට [2] සමාන වේ.
5. බාහිර DNase දූෂණය වළක්වා ගැනීම සඳහා, DNase RNase away පරීක්ෂණ මේසයේ මතුපිට, අත්වැසුම් සහ අනෙකුත් මතුපිට මත ඉසිය හැක. මිනිත්තු 5 කට පසු, පිරිසිදු කඩදාසි තුවා වලින් ඒවා පිරිසිදු කර පසුව පර්යේෂණාත්මක මෙහෙයුම් සිදු කරන්න.
