Vaccinia වෛරස් ආවරණ එන්සයිමය
Vaccinia වෛරස් ආවරණ එන්සයිමය ව්‍යුත්පන්න වී ඇත්තේ ප්‍රතිසංයෝජක E. coli වික්‍රියා මගින් Vaccinia capping එන්සයිමය සඳහා ජාන රැගෙන යයි.මෙම තනි එන්සයිමය උප ඒකක දෙකකින් (D1 සහ D12) සමන්විත වන අතර එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් තුනක් ඇත (ඩී 1 අනු ඒකකය මගින් RNA ට්‍රයිපොස්පේටේස් සහ ගුවානිලයිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස් සහ ඩී 12 අනු ඒකකය මගින් ගුවානීන් මෙතිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස්).Vaccinia virus Capping එන්සයිමය, 7-methylguanylate cap ව්‍යුහය (m7Gppp, Cap 0) RNA හි 5′ අන්තයට විශේෂයෙන් සම්බන්ධ කළ හැකි තොප්පි ව්‍යුහය සෑදීම උත්ප්‍රේරණය කිරීමට ඵලදායී වේ.Cap ව්‍යුහය (Cap 0) mRNA ස්ථායීකරණය, ප්‍රවාහනය සහ යුකැරියෝටේ පරිවර්තනය සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි.එන්සයිම ප්රතික්රියාව මගින් RNA ආවරණය කිරීම ඵලදායී හා සරල ක්‍රමයක් වන අතර එය RNA හි ස්ථායීතාවය සහ පරිවර්තන in vitro පිටපත් කිරීම, මාරු කිරීම සහ ක්ෂුද්‍ර එන්නත් කිරීම සඳහා සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු කළ හැක.
සංරචක
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)
10× ආවරණ බෆරය
ගබඩා කොන්දේසි
ගබඩා කිරීම සඳහා -25～- 15℃ (නැවත නැවත කැටි- දියවන චක්‍ර වළකින්න)
ගබඩා බෆරය
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
Vaccinia virus Capping Enzyme හි එක් ඒකකයක් යනු 37°C උෂ්ණත්වයකදී පැය 1ක් තුළ GTP 10pmol 80nt පිටපතකට ඇතුළත් කිරීමට අවශ්‍ය එන්සයිම ප්‍රමාණය ලෙස අර්ථ දැක්වේ.
තත්ත්ව පාලනය
Exonuclease:10U 1μg λ-Hind III digest DNA සමඟ 10U Vaccinia වෛරස් ආවරණ එන්සයිම 37 ℃ දී පැය 16 ක් සඳහා agarose gel electrophoresis මගින් තීරණය කරන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් ලබා නොදේ.
අන්තරාසර්ග:10U 1μg λDNA සමඟ 1μg λDNA සමඟ 10U 37℃ පැය 16ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් නිර්ණය කරන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් නොලැබේ.
නිකේස්:10U Vaccinia වෛරස් ආවරණ එන්සයිම 1 μg pBR322 සමඟ 37 ℃ පැය 16 ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් මගින් තීරණය කරන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් ලබා නොදේ.
RNase:10U 1.6μg MS2 RNA සමඟ 10U 37℃ උෂ්ණත්වයකදී ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් තීරණය කරන පරිදි පැය 4ක් සඳහා 1.6μg MS2 RNA සහිත එන්සයිමය කිසිදු පරිහානියක් ලබා නොදේ.
1.coli DNA:E. coli 16S rRNA ලොකස් සඳහා විශේෂිත වූ ප්‍රයිමර් සමඟ TaqMan qPCR භාවිතා කරමින් E. coli genomic DNA පැවතීම සඳහා 10U Vaccinia virus Capping Enzyme පරීක්ෂා කරනු ලැබේ.E. coli ජානමය DNA දූෂණය ≤1 E. coli ජෙනෝමය වේ.
2.බැක්ටීරියා එන්ඩොටොක්සින්: LAL-test, Chinese Pharmacopoeia IV 2020 සංස්කරණයට අනුව, ජෙල් සීමාව පරීක්ෂණ ක්‍රමය, සාමාන්‍ය රීතිය (1143).බැක්ටීරියා එන්ඩොටොක්සින් අන්තර්ගතය ≤10 EU/mg විය යුතුය.
ප්රතික්රියා පද්ධතිය සහ කොන්දේසි
1. Capping Protocol (ප්රතික්රියා පරිමාව: 20 μL)
මෙම ක්‍රියා පටිපාටිය 10μg RNA (≥100 nt) හි ආවරණ ප්රතික්රියාව සඳහා අදාළ වන අතර එය පර්යේෂණාත්මක ඉල්ලීම් අනුව පරිමාණය කළ හැක.
I) 10μg RNA සහ Nuclease-free H2O මිලිලීටර් 1.5ක මයික්‍රොෆියුජ් නලයක අවසාන පරිමාව 15.0 µL දක්වා ඒකාබද්ධ කරන්න.*10×කැපින් බෆරය: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 65℃ දී විනාඩි 5 ක් රත් කර විනාඩි 5 ක් අයිස් ස්නානය කරන්න.
3) නිශ්චිත අනුපිළිවෙලෙහි පහත සඳහන් සංරචක එකතු කරන්න
| Cවිරුද්ධකාරයා | Vඔලූම් |
| විකෘති RNA (≤10μg, දිග≥100 nt) | 15 μL |
| 10×කැපින් බෆරය* | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 මි.මී.) | 1 μL |
| Vaccinia වෛරස් ආවරණ එන්සයිමය (10U/μL) | 1 μL |
*10×කැපින් බෆරය: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) 37°C උෂ්ණත්වයේ විනාඩි 30ක් පුර්වාගත කරන්න, RNA දැන් ආවරණය කර ඇති අතර පහළ යෙදුම් සඳහා සූදානම්.
2. 5′ පර්යන්තය ලේබල් කිරීමේ ප්රතික්රියාව (ප්රතික්රියා පරිමාව: 20 μL)
මෙම ප්‍රොටෝකෝලය නිර්මාණය කර ඇත්තේ 5´ ට්‍රයිපොස්පේට් අඩංගු RNA ලේබල් කිරීම සඳහා වන අතර එය ඉල්ලීම් අනුව පරිමාණය කළ හැක.RNA: GTP, මෙන්ම RNA සාම්පලවල GTP අන්තර්ගතයේ මවුල අනුපාතය මගින් ලේබල් සංස්ථාගත කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපානු ඇත.
1) මිලිලීටර් 1.5ක මයික්‍රොෆියුජ් ටියුබ් එකක 14.0 µL අවසාන පරිමාවකට RNA සහ න්‍යෂ්ටික රහිත H2O ප්‍රමාණය සම්බන්ධ කරන්න.
2) 65℃ දී විනාඩි 5 ක් රත් කර විනාඩි 5 ක් අයිස් ස්නානය කරන්න.
3) නිශ්චිත අනුපිළිවෙලෙහි පහත සඳහන් සංරචක එකතු කරන්න.
| Cවිරුද්ධකාරයා | Vඔලූම් |
| අක්‍රිය වූ RNA | 14 μL |
| 10× ආවරණ බෆරය | 2 μL |
| GTP මිශ්‍රණය** | 2 μL |
| SAM (2 මි.මී.) | 1 μL |
| Vaccinia වෛරස් ආවරණ එන්සයිමය (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX යනු GTP සහ කුඩා සලකුණු ගණනකි.GTP සාන්ද්‍රණය සඳහා, යොමු කරන්නසටහනට 3.
4) 37°C උෂ්ණත්වයේ විනාඩි 30ක් පුර්වාගත කරන්න, RNA 5′ අවසානය දැන් ලේබල් කර පහළට යාමට සූදානම්
අයදුම්පත්
1. පරිවර්තන පරීක්ෂණ/විට්‍රෝ පරිවර්තනයට පෙර mRNA ආවරණය කිරීම
2. mRNA හි 5´ අවසානය ලේබල් කිරීම
භාවිතය පිළිබඳ සටහන්
1.RNA ද්‍රාවණය Vaccinia Capping Enzyme සමඟ ඉන්කියුබේෂන් කිරීමට පෙර රත් කිරීමෙන් පිටපතේ 5'අගයේ ඇති ද්විතියික ව්‍යුහය ඉවත් කරයි.දන්නා ඉහළ ව්‍යුහගත 5´අන්ත සහිත පිටපත් සඳහා කාලය විනාඩි 60 දක්වා දීර්ඝ කරන්න.
2. ආවරණ ප්රතික්රියා සඳහා භාවිතා කරන RNA භාවිතයට පෙර පිරිසිදු කර න්‍යෂ්ටික රහිත ජලයේ අත්හිටුවිය යුතුය.EDTA නොතිබිය යුතු අතර විසඳුම ලවණවලින් තොර විය යුතුය.
3. 5´ අන්තය ලේබල් කිරීම සඳහා, සම්පූර්ණ GTP සාන්ද්‍රණය ප්‍රතික්‍රියාවේ mRNA හි මවුල සාන්ද්‍රණය මෙන් 1-3 ගුණයක් පමණ විය යුතුය.
4. ප්රතික්රියා පද්ධතියේ පරිමාව සත්‍යයට අනුව ඉහළට හෝ පහළට පරිමාණය කළ හැක.
