PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) යනු Glycoproteins වලින් N-සම්බන්ධිත oligosaccharides සියල්ලම පාහේ ඉවත් කිරීම සඳහා වඩාත් ඵලදායී එන්සයිම ක්‍රමයයි.PNGase F යනු ඇමිඩේස් එකක් වන අතර එය N-සම්බන්ධිත ග්ලයිකොප්‍රෝටීන වලින් ඉහළ මැනෝස්, දෙමුහුන් සහ සංකීර්ණ ඔලිගොසැකරයිඩවල අභ්‍යන්තර GlcNAc සහ ඇස්පරජින් අපද්‍රව්‍ය අතර බෙදී යයි.
අයදුම්පත
මෙම එන්සයිමය ප්‍රෝටීන වලින් කාබෝහයිඩ්‍රේට් අපද්‍රව්‍ය ඉවත් කිරීමට ප්‍රයෝජනවත් වේ.
සකස් කිරීම සහ පිරිවිතර
| පෙනුම | අවර්ණ දියර |
| ප්රෝටීන් සංශුද්ධතාවය | ≥95% (SDS-PAGE වෙතින්) |
| ක්රියාකාරිත්වය | ≥500,000 U/mL |
| එක්සොග්ලිකොසිඩේස් | කිසිදු ක්‍රියාකාරකමක් අනාවරණය කර ගත නොහැක (ND) |
| එන්ඩොග්ලිකොසිඩේස් F1 | ND |
| එන්ඩොග්ලිකොසිඩේස් F2 | ND |
| එන්ඩොග්ලිකොසිඩේස් F3 | ND |
| එන්ඩොග්ලිකොසිඩේස් එච් | ND |
| ප්රෝටේස් | ND |
දේපළ
| EC අංකය | 3.5.1.52(ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගෙන් ප්‍රතිසංයෝජනය) |
| අණුක බර | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| සම විද්‍යුත් ලක්ෂ්‍යය | 8. 14 |
| ප්රශස්ත pH අගය | 7.0-8.0 |
| ප්රශස්ත උෂ්ණත්වය | 65 °C |
| උපස්ථර විශේෂත්වය | GlcNAc සහ ඇස්පරජින් අපද්‍රව්‍ය අතර ග්ලයිකෝසයිඩ් බන්ධන වෙන් කිරීම Fig.1 |
| හඳුනාගැනීමේ අඩවි | N-සම්බන්ධිත glycans α1-3 ෆියුකෝස් අඩංගු නොවේ නම් Fig. 2 |
| සක්රිය කරන්නන් | DTT |
| නිෂේධකය | SDS |
| ගබඩා උෂ්ණත්වය | -25 ~-15 ℃ |
| තාප අක්රිය වීම | PNGase F 1µL අඩංගු 20µL ප්රතික්රියා මිශ්‍රණයක් විනාඩි 10ක් සඳහා 75 °C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් අක්රිය වේ. |
Fig. 1 PNGase F හි උපස්ථර විශේෂත්වය
Fig. 2 හඳුනාගැනීම PNGase F හි පිහිටයි.
අභ්‍යන්තර GlcNAc අපද්‍රව්‍ය α1-3 ෆියුකෝස් සමඟ සම්බන්ධ කළ විට, PNGase F හට Glycoproteins වලින් N-සම්බන්ධිත oligosaccharides ඉවත් කළ නොහැක.මෙම වෙනස් කිරීම ශාක හා සමහර කෘමි ග්ලයිකොප්‍රෝටීන වල බහුලව දක්නට ලැබේ.
Cවිරුද්ධවාදීන්
|
| සංරචක | සමාධිය |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 μl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
10 µL හි සම්පූර්ණ ප්රතික්රියා පරිමාවකදී පැය 1කදී 37°C දී denatured RNase B 10 µg සිට කාබෝහයිඩ්‍රේට් වලින් 95% ක් ඉවත් කිරීමට අවශ්‍ය එන්සයිම ප්‍රමාණය එක් ඒකකයක් (U) ලෙස අර්ථ දැක්වේ.
ප්රතික්රියා කොන්දේසි
1.10 µl සම්පූර්ණ ප්රතික්රියා පරිමාවක් ඇති කිරීම සඳහා 1-20 µg ග්ලයිකොප්‍රෝටීන් ඩයෝනීකෘත ජලය සමග දියකර, 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer සහ H2O (අවශ්‍ය නම්) එකතු කරන්න.
2.මිනිත්තු 10 ක් සඳහා 100 ° C උෂ්ණත්වයකදී, එය අයිස් මත සිසිල් කරන්න.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 එකතු කර මිශ්ර කරන්න.
4.1-2 µl PNGase F සහ H එකතු කරන්න2O (අවශ්‍ය නම්) 20 µl සම්පූර්ණ ප්රතික්රියා පරිමාවක් සාදා මිශ්ර කරන්න.
5.මිනිත්තු 60 ක් සඳහා 37 ° C දී ප්රතික්රියාව ඉන්කියුබේට් කරන්න.
6.SDS-PAGE විශ්ලේෂණය හෝ HPLC විශ්ලේෂණය සඳහා.
