mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ව්‍යුත්පන්න වී ඇත්තේ mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase එන්නත් සඳහා ජානය රැගෙන යන ප්‍රතිසංයෝජක E. coli වික්‍රියාවකිනි.මෙම එන්සයිමය RNA හි 5'අවසානයේ ඇති කැප් ව්‍යුහයට යාබදව ඇති පළමු නියුක්ලියෝටයිඩයේ 2´-O ස්ථානයේ මෙතිල් කාණ්ඩයක් එක් කරයි.එන්සයිමය S-adenosylmethionine (SAM) මෙතිල් කැප්ඩ් RNA (caped RNA) සඳහා මෙතිල් පරිත්‍යාගකරුවෙකු ලෙස භාවිතා කරයි. -0) කැප්-1 ව්‍යුහයක් ඇති කරයි.
Cap1 ව්‍යුහයට පරිවර්තන කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කළ හැකි අතර, සංක්‍රමණ සහ ක්ෂුද්‍ර ඉන්ජෙක්ෂන් අත්හදා බැලීම් වලදී mRNA ප්‍රකාශනය වැඩි දියුණු කරයි. මෙම එන්සයිමයට උපස්ථරයක් ලෙස m7GpppN කැප් එකක් සහිත RNA අවශ්‍ය වේ.එයට 5´ අවසානයේ pN, ppN, pppN හෝ GpppN සමඟ RNA භාවිතා කළ නොහැක.කැප් ඇනලොග් භාවිතයෙන් වීට්‍රෝ ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ෂන් හරහා හෝ එන්නත් සීනියා කැපිං එන්සයිම භාවිතයෙන් එන්සයිම ආවරණ හරහා කැප්ඩ් ආර්එන්ඒ සකස් කළ හැක.
සංරචක
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)
10× ආවරණ ප්රතික්රියා බෆරය
ගබඞා
-25 ～- 15℃ ගබඩා කිරීම සඳහා
ගබඩා බෆරය
20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% glycerol.
ඒකක අර්ථ දැක්වීම
37°C උෂ්ණත්වයකදී පැය 1කදී nt 80 nt caped RNA පිටපතෙහි pmoles 10 මෙතිලේට් කිරීමට අවශ්‍ය එන්සයිම ප්‍රමාණය ලෙස එක් ඒකකයක් අර්ථ දැක්වේ.
තත්ත්ව පාලන පරීක්ෂණ
Exonuclease:50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase සමඟ 1μg λ-Hind III digest DNA සමඟ 37 ℃ පැය 16ක් සඳහා agarose gel electrophoresis මගින් තීරණය කරන පරිදි කිසිදු පිරිහීමක් නොලැබේ.
Endonuclease: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1 μg λDNA සමඟ 37℃ පැය 16ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් නිර්ණය කරන පරිදි පිරිහීමක් නොලැබේ.
නිකේස්: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg pBR322 සමඟ 37 ℃ පැය 16ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් නිර්ණය කරන පරිදි පිරිහීමක් නොලැබේ.
RNase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase සමඟ 1.6μg MS2 RNA සමඟ 37℃ පැය 4ක් සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් නිර්ණය කරන ලද පරිහානියක් නොලැබේ.
E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase හි පැවැත්ම සඳහා පරීක්ෂා කරනු ලැබේ.E. coli සඳහා විශේෂිත ප්‍රයිමර් සමඟ TaqMan qPCR භාවිතා කරමින් ප්‍රවේණික DNAE. coli 16S rRNA ස්ථානය.එමE. coli ජානමය DNA දූෂණය =1E. coli ජෙනෝමය.
බැක්ටීරියා එන්ඩොටොක්සින්: LAL-test, Chinese Pharmacopoeia IV 2020 සංස්කරණයට අනුව, ජෙල් සීමාව පරීක්ෂණ ක්‍රමය, සාමාන්‍ය රීතිය (1143).බැක්ටීරියා එන්ඩොටොක්සින් අන්තර්ගතය =10 EU/mg විය යුතුය.
ප්රතික්රියා පද්ධතිය සහ කොන්දේසි
1. 1.5 mL මයික්‍රොෆියුජ් ටියුබ් එකක 16.0 µL අවසන් පරිමාවට සුදුසු ප්‍රමාණයකින් ආවරණය කරන ලද RNA සහ RNase-නිදහස් H2O ඒකාබද්ධ කරන්න.
2. විනාඩි 5 ක් සඳහා 65℃ උෂ්ණත්වයකින් පසුව විනාඩි 5 ක් අයිස් ස්නානය කරන්න.
3. නිශ්චිතව දක්වා ඇති අනුපිළිවෙලෙහි පහත සංරචක එකතු කරන්න (Capped RNA මෙතිල්කරණය සඳහා
10 ට අඩු
| සංරචකය | පරිමාව |
| ඉවත් කරන ලද තොප්පි RNA | 16 μL |
| 10X ආවරණ ප්රතික්රියා බෆරය* | 2 μL |
| SAM (4 මි.මී.) | 1 μL |
| mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | 20 μL දක්වා |
*10× ආවරණ ප්රතික්රියා බෆරය: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. පැය 1ක් සඳහා 37℃ උෂ්ණත්වයේ දී ඉන්කියුබේට් කරන්න (ඉලක්ක 200 nt ට අඩු ඛණ්ඩයක් සඳහා පැය 2 ක ඉන්කියුබේෂන් නිර්දේශ කෙරේ).
අයදුම්පත්
ක්ෂුද්‍ර එන්නත් කිරීම සහ මාරු කිරීමේ අත්හදා බැලීම් වලදී mRNA ප්‍රකාශනය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා.
භාවිතය පිළිබඳ සටහන්
1. ප්‍රතික්‍රියාවට පෙර, RNA පිරිසිදු කර න්‍යෂ්ටික රහිත ජලයේ දිය කළ යුතුය, සියලුම ද්‍රාවණවල කිසිදු EDTA සහ අයන අඩංගු නොවිය යුතුය.
2. පිටපතේ 5´අගයේ ඇති ද්විතියික ව්‍යුහය ඉවත් කිරීම සඳහා ප්‍රතික්‍රියාවට පෙර RNA සාම්පල 65℃ ට මිනිත්තු 5ක් රත් කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.සංකීර්ණ 5´-පර්යන්ත ව්‍යුහය සඳහා එය විනාඩි 10 දක්වා දීර්ඝ කළ හැක.
