ද්විත්ව නූල් සහිත RNA (dsRNA) ELISA KIT

මෙම කට්ටලය අනුපිළිවෙල කුමක් වුවත්, පාද යුගල 60 ට වැඩි (bp) දිග dsRNA ප්‍රමාණාත්මකව මැනීම සඳහා, biotin-Streptavidin පද්ධතිය සමඟ සම්බන්ධ වන Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) වේ.තහඩුව ප්‍රති-dsRNA ප්‍රතිදේහයෙන් පූර්ව-ආලේපනය කර ඇත.නියැදියේ ඇති dsRNA එකතු කර ළිං මත ආලේප කර ඇති ප්‍රතිදේහ වලට බන්ධනය වේ.ඉන්පසු biotinylated anti-dsRNA ප්‍රතිදේහ එකතු කර නියැදියේ dsRNA වලට බන්ධනය වේ.සේදීමෙන් පසු HRP-Streptavidin එකතු කර Biotinylated anti-dsRNA ප්‍රතිදේහයට බැඳේ.ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු නොබැඳි HRP-Streptavidin සෝදා හරිනු ලැබේ.එවිට TMB උපස්ථර ද්‍රාවණය HRP මගින් එකතු කර උත්ප්‍රේරණය කර ආම්ලික නැවතුම් ද්‍රාවණයක් එකතු කිරීමෙන් පසු කහ පැහැයට හැරෙන නිල් වර්ණ නිෂ්පාදනයක් නිපදවයි.කහ වල ඝනත්වය තහඩුව තුළ ග්‍රහණය කර ගන්නා dsRNA හි ඉලක්ක ප්‍රමාණයට සමානුපාතික වේ.අවශෝෂණය 450 nm දී මනිනු ලැබේ.

අයදුම්පත

මෙම කට්ටලය අවශේෂ dsRNA වල ප්‍රමාණාත්මක මැනීම සඳහා වේ.

කට්ටල සංරචක

ගබඩා කිරීම සහ ස්ථාවරත්වය

1. භාවිතයට නොගත් කට්ටලය සඳහා: මුළු කට්ටලයම 2 ~ 8 ℃ දී කල් තබා ගත හැක.ගබඩා ස්ථායිතාව සඳහා ශක්තිමත් ආලෝකය වැළැක්විය යුතුය.

2. භාවිතා කළ කට්ටලය සඳහා: මයික්‍රොප්ලේට් විවෘත කළ පසු, කරුණාකර භාවිතයට නොගත් ළිං තහඩු මුද්‍රා යන්ත්‍රයකින් ආවරණය කර ඩෙසිකන්ට් ඇසුරුම අඩංගු තීරු බෑගය වෙත ආපසු යන්න, තීරු බෑගය zip-සීල් කර භාවිතයෙන් පසු හැකි ඉක්මනින් 2~8℃ වෙත ආපසු යන්න.අනෙකුත් ප්‍රතික්‍රියාකාරක භාවිතා කිරීමෙන් පසු හැකි ඉක්මනින් 2~8℃ වෙත ආපසු ලබා දිය යුතුය.

අවශ්‍ය ද්‍රව්‍ය නමුත් සපයා නැත

1. 450±10nm පෙරහන සහිත මයික්‍රොප්ලේට් කියවනය (450 සහ 650 nm තරංග ආයාමයේදී හඳුනාගත හැකි නම් වඩා හොඳය).

2. මයික්රොප්ලේට් ෂේකර්.

3. RNase-නිදහස් ඉඟි සහ කේන්ද්රාපසාරී නල.

මෙහෙයුම් ගැලීම් සටහන

ඔබ ආරම්භ කිරීමට පෙර

1. භාවිතයට පෙර සියලුම කට්ටල සංරචක සහ සාම්පල කාමර උෂ්ණත්වයට (18-25℃) ගෙන එන්න.කට්ටලය එක් වරකදී භාවිතා නොවන්නේ නම්, කරුණාකර වත්මන් අත්හදා බැලීම සඳහා තීරු සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක පමණක් පිටතට ගෙන, ඉතිරි තීරු සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක අවශ්‍ය තත්වයේ තබන්න.

2. වොෂ් බෆරය: මිලි ලීටර් 1× සේදුම් බෆරය මිලි ලීටර් 800ක් පිළියෙළ කිරීම සඳහා 20× සාන්ද්‍රිත සේදුම් බෆරයේ මිලි ලීටර් 40ක් ඩියෝනීකරණය කළ හෝ ආසවනය කළ ජලය මිලි ලීටර් 760ක් සමඟ තනුක කරන්න.

3. සම්මත: භාවිතයට පෙර කොටස් ද්‍රාවණය කෙටියෙන් කරකවන්න හෝ කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න.සපයා ඇති ප්‍රමිතීන් හතරක සාන්ද්‍රණය 5ng/μL වේ.UTP සහ pUTP dsRNA ප්‍රමිති සඳහා, කරුණාකර සම්මත වක්‍රය ඇඳීමට STE බෆරය සමඟ කොටස් විසඳුම 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL තනුක කරන්න.N1-Me-pUTP dsRNA ප්‍රමිති සඳහා, කරුණාකර සම්මත වක්‍රය ඇඳීමට STE බෆරය සමඟ කොටස් විසඳුම 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL තනුක කරන්න.5-OMe-UTP dsRNA ප්‍රමිතිය සඳහා, කරුණාකර සම්මත වක්‍රය ඇඳීමට STE බෆරය සමඟ කොටස් විසඳුම 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL තනුක කරන්න.පහත ප්‍රස්ථාර ලෙස ප්‍රමිතීන් තනුක කළ හැකි බව අපි නිර්දේශ කරමු:

4. Biotinylated හඳුනාගැනීමේ ප්රතිදේහ සහ HRP-streptavidin ක්රියාකාරී විසඳුම: භාවිතයට පෙර කොටස් විසඳුම කෙටියෙන් කරකැවීම හෝ කේන්ද්රාපසාරී කිරීම.තනුක බෆරය සමඟ වැඩ කරන සාන්ද්‍රණයට ඒවා තනුක කරන්න.

5. TMB උපස්ථරය: විෂබීජහරණය කළ ඉඟි සමඟ ද්‍රාවණයේ අවශ්‍ය මාත්‍රාව උකහා ගන්න සහ අවශේෂ ද්‍රාවණය නැවත කුප්පියට දමන්න එපා.TMB උපස්ථරය ආලෝකයට සංවේදී වේ, TMB උපස්ථරය දිගු වේලාවක් ආලෝකයට නිරාවරණය නොකරන්න.

ප්රොටෝකෝලය භාවිතා කිරීම

1. විශ්ලේෂණය සඳහා අවශ්ය තීරු සංඛ්යාව තීරණය කරන්න.භාවිතය සඳහා රාමු තුළ තීරු ඇතුල් කරන්න.මෙම පරීක්ෂණයේදී භාවිතා නොකරන ඉතිරි තහඩු තීරු වියළන ද්‍රව්‍ය සමඟ බෑගයේ නැවත ඇසුරුම් කළ යුතුය.ශීත කළ ගබඩා කිරීම සඳහා බෑගය තදින් වසා දමන්න.

2. සුදුසු ළිංවලට සම්මත, හිස් සහ සාම්පල තනුක 100μL එක් කරන්න.ප්ලේට් සීලර් සමඟ ආවරණය කරන්න.500rpm දී සෙලවීමත් සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් පුර්ව තනන්න.සාම්පල නිවැරදි තක්සේරුව සඳහා සුදුසු සාන්ද්‍රණයට STE බෆරය සමඟ තනුක කළ යුතුය.

3. සේදුම් පියවර: ද්‍රාවණය ඇස්පයිට් කර සෑම ළිඳකටම 250μL සේදුම් බෆරයකින් සෝදා තත්පර 30ක් රැඳී සිටීමට ඉඩ දෙන්න.තහඩුව අවශෝෂක කඩදාසි මතට කඩා දැමීමෙන් සේදුම් බෆරය සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවතලන්න.සම්පූර්ණයෙන්ම 4 වතාවක් සෝදන්න.

4. එක් එක් ළිඳට බයෝටයිනයිලේටඩ් හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදේහ ක්‍රියාකාරී ද්‍රාවණය 100μL එක් කරන්න.ප්ලේට් සීලර් සමඟ ආවරණය කරන්න.500rpm දී සෙලවීමත් සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් පුර්ව තනන්න.

5. නැවත සේදීමේ පියවර.

6. එක් එක් ළිඳට HRP-streptavidin ක්රියාකාරී විසඳුම 100μL එකතු කරන්න.ප්ලේට් සීලර් සමඟ ආවරණය කරන්න.500rpm දී සෙලවීමත් සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන්න.

7. නැවත සේදීමේ පියවර නැවත කරන්න.

8. එක් එක් ළිඳට TMB උපස්ථර ද්‍රාවණය 100μL එක් කරන්න.ප්ලේට් සීලර් සමඟ ආවරණය කරන්න.RT Protect ආලෝකයෙන් විනාඩි 30ක් ඉන්කියුබේට් කරන්න.උපස්ථර ද්‍රාවණය එකතු කිරීමෙන් දියර නිල් පැහැයට හැරේ.

9. එක් එක් ළිඳට නැවතුම් ද්‍රාවණ 50μL එකතු කරන්න.නැවතුම් ද්‍රාවණය එකතු කිරීමෙන් දියර කහ පැහැයට හැරේ.ඉන්පසු මයික්‍රොප්ලේට් රීඩරය ධාවනය කර 450nm හි මැනීම වහාම සිදු කරන්න.

ප්රතිඵල ගණනය කිරීම

1. එක් එක් සම්මත, පාලනය, සහ සාම්පල සඳහා අනුපිටපත් කියවීම් සාමාන්‍යය සහ සාමාන්‍ය ශුන්‍ය සම්මත දෘශ්‍ය ඝනත්වය අඩු කරන්න.සිරස් (Y) අක්ෂය මත අවශෝෂණය සහ තිරස් (X)අක්ෂයේ dsRNA සාන්ද්‍රණය සහිත සම්මත වක්‍රයක් සාදන්න.

2. වක්‍ර විශේෂඥ 1.3 හෝ ELISA Calc වැනි පරිගණක පාදක වක්‍ර-ගැලපෙන මෘදුකාංග සමඟ 5 හෝ 4 පරාමිති රේඛීය නොවන යෝග්‍යතා ආකෘතියකින් ගණනය කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.

කාර්ය සාධනය

1. සංවේදීතාව:

හඳුනාගැනීමේ පහළ සීමාව: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA සඳහා), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA සඳහා).

ප්‍රමාණයේ පහළ සීමාව:0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA සඳහා),0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA සඳහා),0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA සඳහා).

2. නිරවද්‍යතාවය: අභ්‍යන්තර විශ්ලේෂණයේ CV ≤10%, අන්තර්-විශ්ලේෂණයේ CV ≤10%

3. ප්‍රතිසාධනය:80%~120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA සඳහා)0.0312-1pg/μL(N1-Me-pUTP dsRNA සඳහා),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA සඳහා).

සලකා බැලීම්

1. TMB ප්‍රතික්‍රියා උෂ්ණත්වය සහ වේලාව ඉතා වැදගත් වේ, කරුණාකර උපදෙස් වලට අනුව ඒවා පාලනය කරන්න.

2. හොඳ විශ්ලේෂණ ප්රතිනිෂ්පාදනය සහ සංවේදීතාව ලබා ගැනීම සඳහා, අතිරික්ත ප්රතික්රියා නොකළ ප්රතික්රියාකාරක ඉවත් කිරීම සඳහා තහඩු නිසි ලෙස සේදීම අත්යවශ්ය වේ.

3. සියලුම ප්‍රතික්‍රියාකාරක භාවිතයට පෙර හොඳින් මිශ්‍ර කළ යුතු අතර නියැදි හෝ ප්‍රතික්‍රියාකාරක එකතු කිරීමේදී බුබුලු වළක්වා ගත යුතුය.

4. සාන්ද්‍ර වොෂ් බෆරයේ (20x) ස්ඵටික සෑදී ඇත්නම්, සෙල්සියස් අංශක 37 දක්වා උණුසුම් කර ස්ඵටික සම්පූර්ණයෙන්ම විසුරුවා හරින තෙක් මෘදු ලෙස මිශ්ර කරන්න.

5. සෝඩියම් ඇසයිඩ් (NaN3) අඩංගු සාම්පල පරීක්ෂා කිරීමෙන් වළකින්න, එය HRP ක්‍රියාකාරකම් විනාශ කළ හැකි බැවින් dsRNA ප්‍රමාණය අඩු තක්සේරුවකට ලක් විය හැක.

6. පරීක්ෂණය අතරතුර RNase දූෂණයෙන් වළකින්න.

7. සම්මත/නියැදිය, හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදේහ සහ SA-HRP ද සෙලවීමකින් තොරව RT හිදී සිදු කළ හැක, නමුත් මෙය හඳුනාගැනීමේ සංවේදීතාව එක් ගුණයකින් අඩුවීමට හේතු විය හැක.මෙම අවස්ථාව සඳහා, අපි නිර්දේශ කරන්නේ UTP සහ pUTP dsRNA ප්‍රමිතීන් 2pg/μL වලින් තනුක කළ යුතු බවත්, N1-Me-pUTP dsRNA ප්‍රමිතීන් 4pg/μL වලින් තනුක කළ යුතු බවත්, 5-OMe-UTP dsRNA ප්‍රමිතිය 8pg/μL වලින් තනුක කළ යුතු බවත්ය.මීට අමතරව, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 60 ක් සඳහා HRP-streptavidin වැඩ කරන ද්‍රාවණය පුර්ව ගන්වන්න.ප්ලාස්ක් ෂේකර් භාවිතා නොකරන්න, මන්ද ප්ලාස්ක් ෂේකර් සාවද්‍ය ප්‍රතිඵලයක් ඇති කළ හැකිය.

සාමාන්ය ප්රතිඵලය

1. සම්මත වක්‍ර දත්ත

2. සම්මත වක්රය ගණනය කිරීම

3. ලයිනර් හඳුනාගැනීමේ පරාසය: 0.0312- 1pg/μL